Mèsi paske w vizite Nature.com.Vèsyon navigatè w ap itilize a gen sipò CSS limite.Pou pi bon eksperyans, nou rekòmande pou w sèvi ak yon navigatè ki ajou (oswa enfim mòd konpatibilite nan Internet Explorer).Antretan, pou asire sipò kontinye, nou pral rann sit la san estil ak JavaScript.
Metòd etikèt pwoksimite anzimatik ki baze sou ester aktive oswa radikal fenoksi yo lajman itilize pou kat pwoteòm subselilè ak entèraktè pwoteyin nan selil k ap viv.Sepandan, ester aktive yo mwens reyaktif, sa ki lakòz yon reyon etikèt lajè, ak radikal fenoksi ki te pwodwi pa tretman oksijene ka entèfere ak chemen redox.Isit la nou rapòte yon pwoksimite etikèt depandan fotoactivation (PDPL) metòd devlope pa jenetikman ki lye pwoteyin fotosensibilisateur miniSOG nan yon pwoteyin ki enterese.Deklanche pa limyè ble ak kontwole pa tan ekspoze, oksijèn singlet yo pwodwi ak Lè sa a, se spatiotemporally rezoud etikèt nan résidus histidine pa ankèt la anilin reyalize.Nou demontre gwo fidelite li atravè kat pwoteòm òganèl-espesifik.Yon konparezon kòt a kòt nan PDPL ak TurboID montre yon pwoteksyon pwoteomik pi espesifik ak konplè nan PDPL.Apre sa, nou te aplike PDPL nan koaktivatè transkripsyon BRD4 ak E3 Parkin ligase ki asosye ak maladi a epi nou te jwenn entèraktè ki te deja pa konnen.Pa tès depistaj twòp ekspresyon, de substra enkoni, Ssu72 ak SNW1, te idantifye pou Parkin, ki gen degradasyon medyatè pa chemen an ubiquitination-proteasome.
Karakterizasyon egzat nan rezo pwoteyin kache anpil pwosesis selilè fondamantal.Se poutèt sa, kat espasyo-tanporèl trè egzat nan entèraksyon pwoteyin pral bay yon baz molekilè pou dechifre chemen byolojik, patoloji maladi, ak deranje entèraksyon sa yo pou rezon terapetik.Pou sa ka fèt, metòd ki kapab detekte entèraksyon tanporèl nan selil k ap viv oswa tisi yo trè dezirab.Istorikman te itilize espektwometri mas pou pirifikasyon afinite (AP-MS) pou idantifye patnè obligatwa pwoteyin ki enterese yo (POI).Avèk devlopman metòd pwoteomik quantitative, Bioplex3.0 te kreye, pi gwo baz done rezo pwoteyin ki baze sou AP-MS.Malgre ke AP-MS gen anpil pouvwa, liz selil ak etap dilution nan workflow la gen patipri nan direksyon pou entèraksyon obligatwa fèb ak pasajè epi prezante zafè apre liz tankou pè entèraksyon spuri ki manke konpatimantasyon anvan liz.
Pou adrese pwoblèm sa yo, yo devlope asid amine ki pa natirèl (UAA) ak gwoup retik ak platfòm anzimatik ki tou pre etikèt (PL) (eg APEX ak BioID)5.Malgre ke metòd la UAA te aplike avèk siksè nan anpil senaryo epi li bay enfòmasyon sou adezif pwoteyin dirèk, optimize sit la ensèsyon UAA toujou obligatwa.Sa ki pi enpòtan, li se yon metòd etikèt estekyometrik ki manke yon ranvèse katalitik nan evènman etikèt.Kontrèman, metòd anzimatik PL, tankou metòd BioID, fusion biotin ligase a POI7, ki imedyatman aktive biotin pou fòme yon entèmedyè ester biotinyl-AMP reyaktif.Anzim nan konsa katalize ak degaje yon "nwaj" biotin aktive ki mete etikèt sou rezidi lizin proximal yo.Sepandan, BioID mande plis pase 12 èdtan pou jwenn yon siyal ki make ase, ki anpeche itilizasyon li ak rezolisyon tanporèl.Sèvi ak evolisyon dirije ki baze sou ekspozisyon ledven, TurboID te fèt ki baze sou BioID yo dwe pi efikas, sa ki pèmèt etikèt efikas ak biotin nan 10 minit, ki pèmèt pwosesis plis dinamik yo dwe etidye.Paske TurboID se trè aktif ak nivo andojèn biotin yo ase pou etikèt ki ba-nivo, etikèt background vin tounen yon pwoblèm potansyèl lè etikèt ki trè amelyore ak kwonometre egzije pa adisyon nan biotin ekzojèn.Anplis de sa, ester aktive yo mal reyaktif (t1/2 ~ 5 min), sa ki ka mennen nan yon reyon etikèt gwo, espesyalman apre saturation nan pwoteyin vwazen ak biotin 5. Nan yon lòt apwòch, fizyon jenetik nan enjenieri peroksidaz ascorbat (sa vle di biotin- radikal fenol ak pèmèt etikèt pwoteyin nan yon minit 9, 10. APEX se lajman itilize yo idantifye pwoteòm subselilè, konplèks pwoteyin manbràn, ak konplèks siyal pwoteyin sitosolik 11, 12. Sepandan, bezwen an pou gwo konsantrasyon nan peroksid ka afekte pwoteyin redox oswa chemen, deranje. pwosesis selilè.
Kidonk, yon nouvo metòd ki kapab jenere espès repwesyon adiyis ki gen etikèt ki pi reyaktif ak gwo presizyon espasyal ak tanporèl san yo pa deranje wout selilè yo pral yon adisyon enpòtan nan metòd ki egziste deja yo. Pami espès reyaktif yo, oksijèn singlet te eksite atansyon nou akòz lavi kout li yo ak reyon difizyon limite (t1/2 < 0.6 µs nan selil)13. Pami espès reyaktif yo, oksijèn singlet te eksite atansyon nou akòz lavi kout li yo ak reyon difizyon limite (t1/2 < 0.6 µs nan selil)13. Среди активных форм наше внимание привлек синглетный кислород из-за его короткого времени жизни и ограниченного радиуса диффузии (t1/2 < 0,6 мкс в клетках)13. Pami fòm aktif yo, oksijèn singlet atire atansyon nou akòz lavi kout li yo ak reyon difizyon limite (t1/2 < 0.6 µs nan selil)13.在活性物质中，单线态氧因其寿命短和扩散半径有限（细胞中t1/2 < 0.6 µs其寿命短和扩散半径有限（细胞中t1/2 < 0.6 µs 廆活浄滆滆胞 1/2 < 0.6 µs）而引起了我们的注意13 Среди активных форм наше внимание привлекает синглетный кислород из-за его короткого времени жизни и ограниченного радиуса диффузии (t1/2 < 0,6 мкс в клетках). Pami fòm aktif, oksijèn singlet atire atansyon nou paske nan lavi kout li yo ak reyon difizyon limite (t1/2 < 0.6 μs nan selil yo).Oksijèn singlet te rapòte owaza oksidasyon methionine, tirozin, histidine ak triptofan, fè li polè 14,15 pou atachman ak sond ki baze sou amine oswa thiol16,17.Malgre ke oksijèn singlet yo te itilize pou make RNA lòj subselilè, estrateji pou repurposing makè pwoksimite POI andojèn yo rete enkonu.Isit la, nou prezante yon platfòm ki rele photoactivation-dependent proximity labeling (PDPL), kote nou itilize limyè ble pou eklere POI ki kole ak yon fotosensibilisateur miniSOG epi deklanche jenerasyon oksijèn singlet pou oksidasyon rezidi proximal yo, ki te swiv pa modifikasyon ki gen amine pou oksidasyon sond chimik yo. selil k ap viv entèmedyè..Nou teste yon gwoup sond chimik pou maksimize espesifikasyon tag ak idantifye sit modifikasyon lè l sèvi avèk yon workflow pwoteomik ouvè.Yon konparezon kòt a kòt nan PDPL ak TurboID montre yon pwoteksyon pwoteomik pi espesifik ak konplè nan PDPL.Nou aplike apwòch sa a nan makè òganèl espesifik nan pwoteòm subselilè a ak idantifikasyon pwoteòm jeneral nan patnè obligatwa pou kansè ki asosye epigenetik pwoteyin BRD4 ak maladi Parkinson ki asosye E3 ligase Parkin, ki konfime tou de yon rezo pwoteyin li te ye ak yon enkoni. entèraksyon..Kapasite PDPL pou rekonèt substrats E3 nan gwo konplèks pwoteyin reprezante yon sitiyasyon kote yo mande pou rekonesans lyan endirèk yo.De substra parkin enkoni medyatè pa ubiquitination-proteasome yo te konfime in situ.
Terapi fotodinamik (PDT) 19 ak inaktivasyon lazè kwomofò-asistans (CALI) 20, kote limyè iradyasyon ak fotosensibilisateur jenere oksijèn singlet, ka inaktive pwoteyin sib oswa lakòz lanmò selil.Depi oksijèn singlet se yon sibstans trè reyaktif ak yon distans difizyon teyorik apeprè 70 nm, oksidasyon limite espasyal alantou fotosensibilisateur la ka kontwole.Baze sou konsèp sa a, nou deside sèvi ak oksijèn singlet pou reyalize etikèt fèmen nan konplèks pwoteyin nan selil k ap viv yo.Nou devlope yon apwòch chemoproteomic PDPL pou akonpli kat fonksyon: (1) pou katalize jenerasyon oksijèn singlet aktif ki sanble ak apwòch anzimatik PL;(2) bay etikèt ki rezoud nan tan lè inisyasyon limyè;(3) pa chanjman (4) Evite itilize kofaktè andojèn (tankou biotin) pou diminye background, oswa itilize reyaktif ekzojèn ki trè perturban (tankou peroksid) pou minimize ekspoze selil nan estrès anviwònman an.
Fotosensitizers yo ka divize an de kategori ki gen ladan ti fluorofò pwa molekilè (egzanp rose bengal, methylene ble)22 ak jenetikman kode ti pwoteyin (egzanp miniSOG, KillerRed)23.Pou reyalize yon konsepsyon modilè, nou devlope platfòm PDPL premye jenerasyon an lè nou ajoute pwoteyin fotosensibilisateur (PS) nan POI24,25 (Figi 1a).Lè iradyasyon ak limyè ble, oksijèn singlet oksidasyon proximal résidus asid amine nukleofil, sa ki lakòz yon polarite umpolung ki elektwofil epi li ka plis reyaji ak nukleofil pwofonde amine16,17.Pwofonde a fèt ak yon manch alkin pou pèmèt klike sou chimi epi rale desann pou karakterizasyon LC/MS/MS.
Ilistrasyon chematik nan etikèt nan konplèks pwoteyin medyatè pa miniSOG.Lè yo ekspoze a limyè ble, selil ki eksprime miniSOG-POI jenere oksijèn singlet, ki modifye pwoteyin ki kominike men se pa pwoteyin ki pa obligatwa.Pwodui entèmedyè fotooksidasyon yo entèsepte pa etikèt relè nan pwofonde chimik amine pou fòme aduk kovalan.Gwoup alkynyl la sou pwofonde chimi a pèmèt klike sou chimi pou anrichisman pa rale-desann ki te swiv pa LC-MS/MS quantitation.b Estrikti chimik nan sond amine 1-4.c Reprezantan analiz jèl fliyoresan nan mitokondriyo lokalize makè pwoteomik miniSOG-medyatè lè l sèvi avèk sond 1-4 ak quantifikasyon relatif ki baze sou densitometri jèl.Yo te evalye rapò siyal-a-background nan sond chimik lè l sèvi avèk eksperyans kontwòl negatif eksepte limyè ble oswa lè l sèvi avèk selil HEK293T san ekspresyon miniSOG.n = 2 echantiyon byolojik endepandan.Chak pwen reprezante yon kopi byolojik.d Deteksyon reprezantan ak quantifikasyon PDPL lè l sèvi avèk sond optimize 3 nan prezans oswa absans eleman PDPL ki endike yo tankou c.n = 3 echantiyon byolojik endepandan.Chak pwen reprezante yon kopi byolojik.Liy santral ak moustach reprezante mwayèn ak ± devyasyon estanda.CBB: Coomassie Brilliant Blue.e Konfokal D oksijèn singlet ak byen lwen-wouj tach Si-DMA.Ba echèl: 10 µm.D 'jèl ak eksperyans konfokal yo te repete poukont yo omwen de fwa ak rezilta menm jan an.
Nou premye teste kapasite fotosensitizers ki gen matirite miniSOG26 ak KillerRed23, ki estab nan HEK293T, pou medyatè etikèt propargylamine nan proteome a kòm yon pwofonde chimik (figi siplemantè 1a).Analiz fliyoresan jèl te montre ke tout etikèt proteome te reyalize lè l sèvi avèk miniSOG ak iradyasyon limyè ble, pandan ke pa gen okenn pwodwi etikèt vizib yo te obsève ak KillerRed.Pou amelyore rapò siyal-a-background, nou teste yon seri sond chimik ki gen anilin (1 ak 3), propylamine (2), oswa benzylamine (4).Nou te obsève ke selil HEK293T tèt yo te gen yon siyal background ki pi wo konpare ak pa gen okenn limyè ble, pètèt akòz fotosensitizer riboflavin andojèn, flavin mononucleotide (FMN) 27 . Sond chimik ki baze sou anilin 1 ak 3 te bay pi bon espesifik, ak HEK293T ki estab eksprime miniSOG nan mitokondri ki montre yon ogmantasyon > 8 fwa nan siyal pou sond 3, pandan y ap pwofonde 2 yo itilize nan metòd RNA-etikèt CAP-seq sèlman montre ~ 2.5- pliye siyal ogmantasyon, gen anpil chans akòz preferans reyaktivite diferan ant RNA ak pwoteyin (Fig. 1b, c). Sond chimik ki baze sou anilin 1 ak 3 te bay pi bon espesifik, ak HEK293T ki estab eksprime miniSOG nan mitokondri ki montre yon ogmantasyon > 8 fwa nan siyal pou sond 3, pandan y ap pwofonde 2 yo itilize nan metòd RNA-etikèt CAP-seq sèlman montre ~ 2.5- pliye siyal ogmantasyon, gen anpil chans akòz preferans reyaktivite diferan ant RNA ak pwoteyin (Fig. 1b, c).Sond chimik ki baze sou anilin 1 ak 3 te montre pi bon espesifik: HEK293T, ki estab eksprime miniSOG nan mitokondri, montre plis pase yon ogmantasyon 8-pliye nan siyal pou pwofonde 3, pandan y ap pwofonde 2, ki itilize nan metòd etikèt CAP-seq RNA, sèlman. montre ~ 2.5-pliye siyal ogmantasyon, pwobableman akòz preferans diferan reyaksyon ant RNA ak pwoteyin (Fig. 1b, c).苯胺 的 化学 探针 1 和 3 具有 更 的 特异性 特异性 ， HEK293T 在 线 粒体 稳定 稳定 表达 MINISOG ， 3 的 信号 增加> 2.5-倍信号增加，可能是由于RNA 和蛋白质之间的不同反应偏好（图1b，c）。基于 苯胺 化学 探针 1 和 3 具有 的 特异性 特异性 ， HEK293T 在 粒体 稳定 表达 表达 MINISOG ， 探针 3 的 信号 增加 增加> -倍信号增加，可能是由于RNAAnilin ki baze sou pwofonde chimik 1 ak 3 te gen pi bon espesifik, HEK293T ki estab eksprime miniSOG nan mitokondri, ak sond 3 te gen plis pase 8-pliye ogmantasyon nan siyal, pandan y ap pwofonde 2 pou metòd la etikèt CAP-seq RNA te montre sèlman ~ 2.5-pliye ogmantasyon.nan siyal la, pwobableman akòz preferans reyaksyon diferan ant RNA ak pwoteyin (Fig. 1b, c).Anplis de sa, pwofonde 3 izomè ak sond idrazin (sond 5, 6, 7) yo te teste, ki konfime optimize pwofonde 3 (figi siplemantè 1b, c).Menm jan an tou, analiz fliyoresan nan jèl revele lòt paramèt eksperimantal optimize: longèdonn iradyasyon (460 nm), konsantrasyon pwofonde chimik (1 mM), ak tan iradyasyon (20 min) (figi siplemantè 2a-c).Omisyon nenpòt eleman oswa etap nan pwotokòl la PDPL te lakòz yon ranvèse siyal enpòtan nan background nan (Fig. 1d).Miyò, etikèt pwoteyin yo te siyifikativman redwi nan prezans azid sodyòm oswa trolox, ki konnen yo pasè oksijèn singlet.Prezans D2O, ki konnen pou estabilize oksijèn singlet, amelyore siyal etikèt la.Pou mennen ankèt sou kontribisyon lòt espès oksijèn reyaktif nan etikèt, mannitol ak vitamin C yo te ajoute pou etabli hydroxyl ak superoksid radikal scavengers, respektivman, 18, 29, men yo pa te jwenn diminye etikèt.Adisyon H2O2, men se pa ekleraj, pa t 'gen rezilta nan etikèt (Siplemantè Fig. 3a).D' oksijèn fliyoresan singlet ak sond Si-DMA konfime prezans oksijèn singlet nan fil HEK293T-miniSOG, men se pa nan fil HEK293T orijinal la.Anplis de sa, mitoSOX Wouj pa t 'kapab detekte pwodiksyon supèroksid apre lumières (Fig. 1e ak Fig. Siplemantè 3b) 30. Done sa yo fòtman sijere ke oksijèn singlet se espès prensipal oksijèn reyaktif ki responsab pou etikèt pwoteomik ki vin apre.Sitotoksisite nan PDPL te evalye ki gen ladan iradyasyon limyè ble ak sond chimik, epi pa gen okenn sitotoksisite enpòtan yo te obsève (Siplemantè Fig. 4a).
Yo nan lòd yo etidye mekanis nan etikèt epi pèmèt idantifikasyon pwoteomik nan konplèks pwoteyin lè l sèvi avèk LC-MS / MS, nou premye bezwen detèmine ki asid amine yo modifye ak mas nan delta nan etikèt pwofonde.Methionine, histidine, tryptophan ak tirozin yo te rapòte yo dwe modifye pa oksijèn singlet14,15.Nou entegre workflow TOP-ABPP31 ak rechèch san patipri louvri platfòm enfòmatik FragPipe ki baze sou MSFragger32.Apre modifikasyon oksijèn singlet ak etikèt pwofonde chimik, klike sou chimi yo te fèt lè l sèvi avèk yon etikèt rediksyon biotin ki gen yon linker cleavable, ki te swiv pa etann neutravidin ak dijesyon tripsin.Peptid modifye a, ki toujou mare ak résine a, te fotocleaved pou analiz LC-MS/MS (Figi 2a ak Done Siplemantè 1).Yon gwo kantite modifikasyon ki te fèt nan tout proteome a ak plis pase 50 alimèt kat peptide (PSM) ki nan lis (Fig. 2b).Surprenante, nou sèlman obsève modifikasyon nan histidine, pwobableman akòz reyaksyon ki pi wo nan histidine oksidize nan direksyon pou sond anilin pase lòt asid amine.Dapre mekanis ki pibliye nan oksidasyon histidine pa oksijèn singlet, 21,33 estrikti delta-mas pwopoze a nan + 229 Da koresponn ak adduct nan sond 3 ak 2-oxo-histidine apre de oksidasyon, pandan y ap + 247 Da se pwodwi a idroliz. nan + 229 Da (figi siplemantè 5).Evalyasyon an nan MS2 spectre te montre yon gwo fyab nan idantifikasyon nan pi fò nan iyon yo y ak b, ki gen ladan idantifikasyon an nan iyon fragman modifye (y ak b) (Fig. 2c).Analiz kontèks sekans lokal histidine modifye PDPL revele yon preferans motif modere pou ti rezidi idrofob nan pozisyon ± 1 (figi siplemantè 4b).An mwayèn, 1.4 histidine yo te idantifye pou chak pwoteyin, ak sit makè sa yo te detèmine pa sòlvan sifas aksesib a (SASA) ak analiz disponiblite sòlvan relatif (RSA) (Siplemantè Fig. 4c, d).
Yon workflow san patipri pou etidye selektivite rezidyèl lè l sèvi avèk platfòm enfòmatik FragPipe ki mache ak MSFragger.Linkers Cleavable yo itilize nan Chimi Klike pou pèmèt fotoklivaj peptides modifye soti nan résine streptavidin.Yo te lanse yon rechèch ouvè pou idantifye anpil modifikasyon, ansanm ak rès ki enpòtan yo.b Bay mas modifikasyon k ap fèt nan tout pwoteòm nan.Kat peptides PSM.c MS2 spectral annotation nan sit histidine modifye ak sond 3. Kòm yon egzanp reprezantatif, yon reyaksyon kovalan ak sond 3 te ajoute +229.0938 Da nan asid amine modifye.d Egzamen mitasyon yo itilize pou teste makè PDPL yo.PRDX3 (H155A, H225A) ak PRDX1 (H10A, H81A, H169A) te transfekte ak plasmid kalite sovaj pou deteksyon anti-drapo.e Peptid sentetik la te reyaji ak miniSOG pirifye nan prezans pwofonde 3 ak pwodwi korespondan yo ak Δm +247 ak +229 yo te note nan spectre LC-MS la.f Entèraksyon an vitro pwoteyin-a-pwoteyin modle ak miniSOG-6xHis-tag ak anti-6xHis antikò.Antibyotin (streptavidin-HRP) ak anti-sourit analiz Western blot nan konplèks antikò miniSOG-6xHis/anti-6xHis ki make ak sond 3, tou depann de tan an nan ekspoze a limyè.Etikèt pou pwoteyin endividyèl yo eksprime nan pwa molekilè ki koresponn lan: LC antikò chèn limyè, HC antikò chèn lou.Eksperyans sa yo te repete poukont yo omwen de fwa ak rezilta menm jan an.
Pou verifikasyon byochimik nan sit etikèt la, PRDX3 ak PRDX1 idantifye pa espektrometri mas yo te chanje soti nan histidine nan alanin ak konpare ak kalite sovaj nan tès transfeksyon.Rezilta PDPL yo te montre ke mitasyon an siyifikativman redwi etikèt (figi 2d).Pandan se tan, sekans peptide yo idantifye nan rechèch la louvri yo te sentèz ak reyaji an vitro ak miniSOG pirifye nan prezans sond 3 ak limyè ble, ki bay pwodwi ak yon chanjman mas nan +247 ak +229 Da lè detekte pa LC-MS (Fig. .2e).).Pou teste si wi ou non pwoteyin proximal kominike yo ta ka make an vitro an repons a fotoaktivasyon miniSOG, nou te fèt yon tès pwoksimite atifisyèl pa entèraksyon ant pwoteyin miniSOG-6xHis la ak yon antikò monoklonal anti-Li an vitro (Figi 2f).Nan tès sa a, nou te espere etikèt proximal nan chenn antikò lou ak limyè ak miniSOG.An reyalite, anti-sourit (rekonèt chenn yo lou ak limyè nan antikò anti-6xHis ki make) ak streptavidin Western blots te montre fò biotinylation nan chenn yo lou ak limyè.Miyò, nou remake miniSOG otobyotinilasyon akòz tag 6xHis ak kwa-lyen ant chenn limyè ak lou, ki ka gen rapò ak diferans ki te deja dekri ant lizin ak 2-oxo-histidine repons proximal.An konklizyon, nou konkli ke PDPL modifye histidine nan yon fason ki depann de pwoksimite.
Objektif pwochen nou an se te karakterize pwoteòm subselilè a pou teste espesifik nan etikèt in situ.Se poutèt sa, nou estab eksprime miniSOG nan nwayo a, matris mitokondriyo, oswa manbràn ER ekstèn nan selil HEK293T (figi 3a).Analiz fliyoresan jèl revele bann ki make abondan nan twa kote subselilè ak diferan modèl etikèt (figi 3b).Analiz D Fluorescence te montre gwo espesifik nan PDPL (Fig. 3c).Flux travay PDPL la te swiv pa reyaksyon klike ak koloran rhodamine pou delimiter proteom subselilè lè l sèvi avèk mikwoskospi fliyoresan, ak siyal PDPL yo te colocalized ak DAPI, trackers mitokondriyo, oswa trackers ER, ki konfime fidelite segondè nan PDPL.Pou twa kote òganèl yo, yon konparezon kòt a kòt nan PDPL ak TurboID lè l sèvi avèk avidin Western blot te montre ke PDPL te make plis espesyalman konpare ak kontwòl respektif yo.Anba kondisyon PDPL, plis gwoup ki make te parèt, ki endike plis pwoteyin ki make PDPL (figi siplemantè 6a-d).
yon reprezantasyon Schematic nan miniSOG-medyatè òganèl-espesifik etikèt pwoteòm.miniSOG vize matris mitokondriyo a atravè fizyon nan N-tèminal 23 asid amine COX4 imen an (mito-miniSOG), nwayo a atravè fizyon H2B (nwayo-miniSOG), ak Sec61β atravè bò sitoplasmik manbràn ER la (ER-miniSOG). ).Endikasyon yo enkli imaj jèl, imaj konfokal, ak espektrometri mas.b Imaj jèl reprezantan twa pwofil PDPL òganèl espesifik yo.CBB Coomassie Brilliant Blue.c Imaj konfokal reprezantan selil HEK293T ki estab ki eksprime miniSOG ak diferan lokalizasyon subselilè detekte pa antikò ki make V5 (wouj).Makè subselilè yo itilize pou mitokondri ak ER (vèt).Flux travay PDPL la gen ladan deteksyon miniSOG (jòn) ki gen etikèt pwoteòm subselilè lè l sèvi avèk chimi klike sou Cy3-azide.Ba echèl: 10 µm.d Trase vòlkanik nan pwoteòm ki make PDPL nan divès òganèl ki mezire pa kantite ki pa make (n = 3 eksperyans byolojik endepandan).Yo te itilize tès t Elèv de-ke sou trase vòlkan yo.HEK293T kalite sovaj te itilize kòm yon kontwòl negatif. Siyifikativman chanje pwoteyin yo make an wouj (p <0.05 ak> 2-pliye diferans entansite ion). Siyifikativman chanje pwoteyin yo make an wouj (p <0.05 ak> 2-pliye diferans entansite ion). Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и >2-кратная разница в интосница в интесным цветом). Siyifikativman chanje pwoteyin yo make an wouj (p <0.05 ak> 2-pliye diferans nan entansite ion).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0.05 和> 2 倍离子强度差异）。显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0.05和> 2 Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и > 2-кратная разница в ионлей ионлей). Siyifikativman chanje pwoteyin yo make an wouj (p <0.05 ak> 2-pliye diferans nan fòs iyonik).Pwoteyin ki gen rapò ki enpòtan pou HEK293T-miniSOG men ki pa enpòtan pou HEK293T yo montre an vèt.e Analiz espesifik nan seri done pwoteomik ki soti nan eksperyans d.Kantite total pwoteyin estatistik enpòtan nan chak òganèl (pwen wouj ak vèt) make nan tèt la.Istogram yo montre pwoteyin lokalize nan òganèl ki baze sou MitoCarta 3.0, analiz GO ak A. Ting et al.moun.Ansanm done separe pou mitokondri, nwayo, ak ER.Eksperyans sa yo te repete poukont yo omwen de fwa ak rezilta menm jan an.Done kri yo bay sou fòm dosye done kri.
Ankouraje pa rezilta jèl ak imaj yo, yo te itilize quantification san etikèt pou quantifier proteome idantifye nan chak òganèl (Done siplemantè 2).HEK293T ki pa transfekte yo te itilize kòm yon kontwòl negatif pou fè soustraksyon makè background yo. Analiz trase vòlkan yo montre pwoteyin ki anrichi anpil (p <0.05 ak > 2-pliye entansite ion) ansanm ak pwoteyin singleton ki prezan sèlman nan liy ki eksprime miniSOG (figi 3d pwen wouj ak vèt). Analiz trase vòlkan yo montre pwoteyin ki anrichi anpil (p <0.05 ak > 2-pliye entansite ion) ansanm ak pwoteyin singleton ki prezan sèlman nan liy ki eksprime miniSOG (figi 3d pwen wouj ak vèt). Анализ графика вулкана показал значительно обогащенные белки (p <0, 05 и > 2-кратная интенсивность ионов), а также одиночные белки, которые присутствуют только в линиях, экспрессирующих miniSOG (рис. 3d, красные и зеленые точки). Analiz trase vòlkan yo te montre pwoteyin siyifikativman rich (p<0.05 ak > 2-pliye entansite ion) osi byen ke pwoteyin sèl ki prezan sèlman nan liy miniSOG-eksprime (figi 3d, pwen wouj ak vèt).火山图 显示 出 显着 富集 蛋白质 （p <0.05 和> 2 倍 离子 强度 以及 仅 存 在于 在于 在于 在于 在于 红色 和 系 中 的火山图 分析 显示 显着 的 （p <0.05 和> 2 倍 离子） 仅 存 在于 在于 在于 在于 在于 在于 表达 表达 的 单一 蛋白质 （图 图 图 红色 红色 绿色点 。。。）））））））））） Анализ графика вулкана выявил значительно обогащенные белки (p <0, 05 и> 2x ионная сила), а также отдельные белки, присутствующие только в экспрессионной линии miniSOG (красные и зеленые точки на рис. 3d). Analiz trase vòlkan an te revele pwoteyin siyifikativman anrichi (p<0.05 ak> 2x fòs iyonik) osi byen ke pwoteyin sèl sèlman prezan nan liy ekspresyon miniSOG la (pwen wouj ak vèt nan Fig. 3d).Konbine done sa yo, nou idantifye 1364, 461, ak 911 estatistik siyifikatif nikleyè, mitokondriyo, ak ER pwoteyin manbràn ekstèn, respektivman.Pou analize presizyon nan òganèl-lokalize PDPL, nou itilize MitoCarta 3.0, Gene Ontology (GO) analiz, ak A. Ting et al.yo te itilize yon seri done8 pou mitokondri, nwayo, ak ER pou teste espesifik òganèl pwoteyin yo detekte, ki koresponn ak yon presizyon nan 73.4, 78.5, ak 73.0% (Fig. 3e).Espesifik PDPL konfime ke PDPL se yon zouti ideyal pou idantifye pwoteòm òganèl espesifik yo.Miyò, analiz submitokondriyo nan pwoteyin mitokondriyo idantifye te montre ke proteome kwense a te sitou distribye nan matris la ak manbràn enteryè (226 ak 106, respektivman), kontablite pou 91.7% (362) nan kantite total pwoteyin mitokondriyo idantifye.yon wo nivo PDPL te konfime anplis (figi siplemantè 7a).Menm jan an tou, analiz subnuclear te montre ke proteome kaptire a te sitou distribye nan nwayo a, nukleoplasm, ak nukleolus (Siplemantè Fig. 7b).Analiz pwoteomik nikleyè ak yon peptide siyal lokalizasyon nikleyè (3xNLS) te montre menm presizyon ak konstriksyon H2B a (figi siplemantè 7c-h).Pou detèmine espesifik makè PDPL la, yo te chwazi laminin nikleyè A kòm yon pèlen POI7 ki pi diskrèman lokalize.PDPL te idantifye 36 pwoteyin siyifikativman anrichi, nan yo ki 12 pwoteyin (30.0% ki gen ladan lamin A) te byen karakterize pwoteyin lamin A kominike anote pa baz done a String, ak yon pousantaj ki pi wo pase metòd la BioID (122 pwoteyin) 28 nan 28. , 22.9 %) 7. Metòd nou an te idantifye mwens pwoteyin, petèt akòz zòn etikèt limite, ki te posib grasa oksijèn singlet ki pi aktif.Analiz GO te montre ke pwoteyin yo idantifye yo te sitou sitiye nan nukleoplasm la (26), manbràn nikleyè (10), manbràn nikleyè (9), ak porositë nikleyè (5).Ansanm, pwoteyin lokalizasyon nikleyè sa yo te reprezante 80% nan pwoteyin rich yo, plis demontre espesifik nan PDPL (figi siplemantè 8a-d).
Lè nou te etabli kapasite PDPL pou fè make pwoksimite nan òganèl, nou teste si wi ou non PDPL ta ka itilize pou analize patnè obligatwa POI yo.An patikilye, nou t ap chèche defini analiz PDPL nan pwoteyin sitosol, ki konsidere kòm sib pi difisil pase tokay manbràn lokalize yo akòz nati trè dinamik yo.Bromodomain ak extraterminal (BET) pwoteyin BRD4 te atire atansyon nou pou wòl kle li nan divès maladi 35, 36.Konplèks ki fòme pa BRD4 se yon koactivateur transcriptional ak yon sib enpòtan terapetik.Lè yo regle ekspresyon faktè transkripsyon c-myc ak Wnt5a, BRD4 panse se yon detèminan kle nan lesemi egi myeloid (AML), myeloma miltip, lenfom Burkitt, kansè nan kolon ak maladi enflamatwa37,38.Anplis de sa, kèk viris vize BRD4 pou kontwole transkripsyon viral ak selilè, tankou papillomavirus, VIH, ak SARS-CoV-236,39.
Pou kat entèraksyon BRD4 lè l sèvi avèk PDPL, nou konbine miniSOG ak yon izofòm N- oswa C-tèminal kout nan BRD4.Rezilta Proteomic revele yon wo degre de sipèpoze ant de konstriksyon yo (Siplemantè Fig. 9a).Proteome nikleyè idantifye ak miniSOG-H2B kouvri 77.6% nan pwoteyin yo kominike avèk BRD4 (figi siplemantè 9b).Lè sa a, diferan tan ekleraj (2, 5, 10, 20 min) yo te itilize pou ajiste reyon makè a (figi 4a ak done siplemantè 3).Nou konkli ke nan fotoperyod ki pi kout, PDPL pral prensipalman make patnè obligatwa dirèk, pandan y ap peryòd ki pi long yo pral gen ladan pwoteyin ki idantifye pandan peryòd fotoaktivasyon ki pi kout kòm byen ke sib endirèk nan konplèks etikèt.An reyalite, nou te jwenn sipèpoze fò ant pwen tan adjasan (84.6% pou 2 ak 5 min; 87.7% pou 5 ak 10 min; 98.7% pou 10 ak 20 min) (figi 4b ak Figi siplemantè 9c).Nan tout gwoup eksperimantal, nou jwenn non sèlman BRD4 pwòp tèt ou etikèt, men plizyè objektif li te ye tankou MED1, CHD8, BICRA, NIPBL, SMC1A, ak HMGB1 anote nan baz done a fisèl.Fòs iyonik sib sa yo pwopòsyonèl ak tan ekspoze a (figi 4c ak Figi siplemantè 9d).GO analiz de pwoteyin yo idantifye nan gwoup la 2 minit te montre ke pwoteyin yo idantifye yo te lokalize nan nwayo a epi yo te patisipe nan renovasyon chromatin ak fonksyon RNA polymerase.Fonksyon molekilè pwoteyin lan te rich nan kwomatin obligatwa oswa koaktivasyon transcription, ki konsistan avèk fonksyon BRD4 (figi 4d).Analiz entèraksyon pwoteyin ki pèmèt baz done kòd te revele yon premye nivo entèraksyon endirèk ant BRD4 ak HDAC fanmi kominike konplèks tankou SIN3A, NCOR2, BCOR, ak SAP130 (Fig. 4e ak Fig. Siplemantè 9e), ki konsistan avèk BRD4 ak HDAC obligatwa histones acetylated. ..Anplis de sa, sib reprezantan idantifye pa LC-MS / MS, ki gen ladan Sin3A, NSUN2, Fus, ak SFPQ, te konfime pa Western blotting (Fig. 4f).Dènyèman, yo te rapòte izoform kout BRD4 pou fòme nwayo ak pwopriyete likid-likid separasyon faz (LLPS).Pwoteyin obligatwa RNA Fus ak SFPQ medyatè LLPS nan divès pwosesis selilè epi yo te idantifye isit la kòm pwoteyin obligatwa BRD4 ki pa anrejistre.Entèraksyon ki genyen ant BRD4 ak SFPQ te konfime pa eksperyans ko-immunoprecipitation (ko-IP) (Figi 4g), sijere yon lòt mekanis pou separasyon faz likid-likid BRD4-medyatè merite plis envestigasyon.Ansanm, rezilta sa yo sijere ke PDPL se yon platfòm ideyal pou idantifye BRD4 li te ye ansanm ak pwoteyin obligatwa enkoni.
yon reprezantasyon eskematik maketing pwoksimite BRD4 miniSOG, tan ekspoze: 2, 5, 10, ak 20 min.b Sipèpoze pwoteyin yo idantifye nan diferan moman ekleraj.Anrichisman pwoteyin idantifye nan HEK293T-miniSOG-BRD4 te estatistik siyifikatif konpare ak HEK293T sovaj.c Entansite iyon lè yo quantifiere reprezantan ki pa gen etikèt ke yo rekonèt BRD4-obligatwa pwoteyin pandan tan an ekspoze espesifye.n = 3 echantiyon byolojik endepandan.Done yo prezante kòm mwayen ± devyasyon estanda.d Jenetik analiz ontolojik (GO) nan pwoteyin yo idantifye nan gwoup la 2 minit.Yo site dis premye tèm GO yo.Ti wonn yo gen koulè dapre kategori tèm GO a, epi gwosè ti wonn yo pwopòsyonèl ak kantite pwoteyin yo jwenn nan chak tèm.e Analiz chèn nan pwoteyin ki kominike avèk BRD4.Ti sèk jòn yo se lakòl dirèk ak ti sèk gri yo se premye kouch lakòl endirèk.Liy wouj yo reprezante entèraksyon yo detèmine eksperimantal ak liy ble yo reprezante entèraksyon yo prevwa.f Reprezantan sib obligatwa BRD4 idantifye nan LC-MS/MS yo te verifye pa Western blotting.g Eksperyans ko-iminopresipasyon konfime entèraksyon ant SFPQ ak BRD4.Eksperyans sa yo te repete poukont yo omwen de fwa ak rezilta menm jan an.Done kri yo bay sou fòm dosye done kri.
Anplis de sa nan idantifye objektif ki pa anrejistre POI ki asosye, nou ipotèz ke PDPL pral apwopriye pou idantifye substrats pou anzim, ki ta mande pou karakterizasyon pwoteyin obligatwa endirèk nan gwo konplèks anote substrats ki pa anrejistre.Parkin (kode pa PARK2) se yon ligaz E3 ak mitasyon nan parkin yo konnen ki lakòz maladi Parkinson nan jivenil otozomal resesif (AR-JP)42.Anplis de sa, yo te dekri parkin kòm esansyèl pou mitofaji (mitokondriyo otofaji) ak retire espès oksijèn reyaktif.Sepandan, byenke plizyè substra parkin yo te idantifye, wòl nan parkin nan maladi sa a rete klè.Pou anote substrats ki pa karakterize li yo, yo te teste PDPL lè yo ajoute miniSOG nan N- oswa C-tèminal parkin.Selil yo te trete ak carbonyl cyanide proton transporter m-chlorophenylhydrazone (CCCP) pou aktive parkin atravè chemen PINK1-Parkin.Konpare ak rezilta BRD4 PDPL nou yo, fizyon parkin N-tèminal revele yon pi gwo seri pwoteyin sib, byenke li kouvri yon pi gwo pòsyon nan C-tèminal la (177 soti nan 210) (Figi 5a, b ak Done Siplemantè 4).rezilta a se ki konsistan avèk rapò ke tags N-tèminal ka aberrantly aktive Parkin44.Etonan, te gen sèlman 18 pwoteyin sipèpoze nan done nou yo ak rezilta AP-MS pibliye pou Parkin43, gen anpil chans akòz diferans ki genyen ant liy selilè ak workflows proteomik.Anplis de kat pwoteyin li te ye (ARDM1, HSPA8, PSMD14, ak PSMC3) idantifye pa de metòd (Fig. 5c)43.Pou plis valide rezilta yo nan LC-MS / MS, tretman PDPL ak ki vin apre Western blotting yo te itilize yo konpare rezilta yo nan tès selil paran HEK293T la ak liy ki estab N-tèminal parkin.Sib CDK2, DUT, CTBP1, ak PSMC4 ki te enkoni anvan yo te teste ak yon lyan li te ye, DNAJB1 (Fig. 5d).
Trase vòlkan nan pwoteyin ki entèraksyon ak parkin nan selil HEK293T ak miniSOG ki estab ki eksprime kole ak N- oswa C-tèminal nan parkin (n = 3 eksperyans byolojik endepandan).Yo te itilize tès t Elèv de-ke sou trase vòlkan yo.HEK293T te itilize kòm yon kontwòl negatif. Siyifikativman chanje pwoteyin yo make an wouj (p <0.05 ak> 2-pliye diferans entansite ion). Siyifikativman chanje pwoteyin yo make an wouj (p <0.05 ak> 2-pliye diferans entansite ion). Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и >2-кратная разница в интосница в интесным цветом). Siyifikativman chanje pwoteyin yo make an wouj (p <0.05 ak> 2-pliye diferans nan entansite ion).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0.05 和> 2 倍离子强度差异）。显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0.05和> 2 Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и > 2-кратная разница в ионлей ионлей). Siyifikativman chanje pwoteyin yo make an wouj (p <0.05 ak> 2-pliye diferans nan fòs iyonik).Pwoteyin ki gen rapò ki enpòtan pou HEK293T-miniSOG men ki pa enpòtan pou HEK293T yo montre an vèt.b Dyagram Venn ki montre sipèpoze pwoteyin ant N-tèminal ak C-tèminal konstwi.Tags N-tèminal yo ka aktive pakin ak rezilta nan pwoteyin ki pi rekonètr.c Dyagram Venn ki montre pwoteyin sipèpoze ant PDPL ak AP-MS.Entèaktè li te ye yo ki nan lis, ki gen ladan 4 nan 18 pwoteyin sipèpoze ak 11 nan 159 pwoteyin espesifikman idantifye nan PDPL.d LC-MS/MS idantifye objektif reprezantatif yo te verifye pa Western blot.e Ssu72 ak SNW1 te idantifye kòm substrats Parkin ki pa anrejistre.Plasmid pwoteyin ki make FLAG sa yo te transfekte nan HEK293T ak HEK293T-Parkin-miniSOG ki te swiv pa tretman CCCP nan plizyè moman.Degradasyon an te pi pwononse nan liy overexpression Parkin.f Sèvi ak inibitè proteazòm MG132 la, li te konfime ke pwosesis degradasyon Ssu72 ak SNW1 medyatè pa proteasome-ubiquitination.Eksperyans sa yo te repete poukont yo omwen de fwa ak rezilta menm jan an.Done kri yo bay sou fòm dosye done kri.
Miyò, pwoteyin yo idantifye pa PDPL dwe gen ladan pwoteyin ki gen parkin-obligatwa ak substrats yo.Pou detekte substrats Parkin ki pa anrejistre, nou chwazi sèt pwoteyin idantifye (PUF60, PSPC1, UCHL3, PPP1R8, CACYBP, Ssu72 ak SNW1) ak plasmid transfekte pou ekspoze jèn sa yo nan HEK293T nòmal epi eksprime stab miniSOG-Parkin HEK293T ki te swiv pa tretman CCCP.Nivo pwoteyin Ssu72 ak SNW1 yo te siyifikativman redwi nan liy ki estab miniSOG-Parkin (figi 5e).Tretman ak CCCP pou 12 èdtan te lakòz degradasyon ki pi enpòtan nan tou de substrats.Pou mennen ankèt sou si degradasyon Ssu72 ak SNW1 reglemante pa proteasome-ubiquitination, yo te ajoute inibitè proteasome MG132 pou anpeche aktivite proteasome, e an reyalite nou te jwenn ke pwosesis degradasyon yo te anpeche (Fig. 5f).Lòt objektif ki pa substrate yo te konfime kòm entèraktè Parkin lè l sèvi avèk Western blotting (Siplemantè Fig. 10), ki te montre rezilta ki konsistan avèk LC-MS / MS.An konklizyon, entegrasyon workflow PDPL la ak verifikasyon transfeksyon pwoteyin sib pèmèt idantifikasyon substrat E3 ligase ki pa anrejistre.
Nou te devlope yon platfòm komen pwoksimite make ki pèmèt ou idantifye nan espas ak tan kominike POI.Platfòm lan baze sou pwoteyin fotosensibilisateur miniSOG, ki se sèlman apeprè 12 kDa, mwens pase mwatye gwosè anzim APEX2 ki gen matirite (27 kDa) ak yon tyè gwosè TurboID (35 kDa).Gwosè ki pi piti a ta dwe elaji anpil ranje aplikasyon pou etidye ti entèratom pwoteyin.Plis eksplorasyon nan fotosensibilisateur adisyonèl, si wi ou non pwoteyin jenetikman kode oswa ti molekil, yo bezwen ogmante sede a pwopòsyon nan oksijèn singlet ak elaji sansiblite a nan apwòch sa a.Pou vèsyon aktyèl miniSOG, yo ka reyalize gwo rezolisyon tanporèl lè l sèvi avèk ekleraj ble pou aktive makè pwoksimite yo.Anplis de sa, tan ekspoze pi long lage yon pi gwo "nwaj" nan oksijèn singlet, sa ki lakòz modifikasyon nan plis rezidi histidin distal, ogmante reyon etikèt, ak kapasite nan afine rezolisyon espasyal PDPL la.Nou menm tou nou teste sèt sond chimik pou ogmante rapò siyal-a-background epi eksplore mekanis molekilè ki dèyè apwòch sa a.Workflow TOP-ABPP konbine avèk rechèch san patipri ouvè te konfime ke modifikasyon te fèt sèlman nan histidines epi yo pa te obsève okenn mikwo-anviwònman ki konsistan pou ogmante modifikasyon histidine, eksepte pou yon preferans modere pou histidine nan rejyon an bouk.
PDPL te itilize tou pou karakterize proteom subselilè ak spesifik pwoteòm ak pwoteksyon omwen konparab ak lòt etikèt pwoksimite ak metòd pwofonde chimik òganèl espesifik.Makè pwoksimite yo te itilize tou avèk siksè pou karakterize pwoteòm sifas, lizozomal, ak sekretèm ki asosye46,47.Nou kwè ke PDPL pral konpatib ak òganèl subselilè sa yo.Anplis de sa, nou te defye PDPL nan idantifye sib pou lyezon pwoteyin sitosol ki pi konplèks pase pwoteyin manbràn akòz pwopriyete dinamik yo ak patisipasyon nan plis entèraksyon tanporèl.PDPL te aplike nan de pwoteyin, transkripsyon coactivator BRD4 ak maladi-asosye ligase E3 Parkin la.De pwoteyin sa yo te chwazi pa sèlman pou fonksyon byolojik fondamantal yo, men tou pou enpòtans klinik yo ak potansyèl terapetik yo.Pou de POI sa yo, yo te idantifye patnè obligatwa byen li te ye yo ansanm ak sib ki pa anrejistre.Miyò, SFPQ pwoteyin ki asosye ak separasyon faz la te konfime pa ko-IP, ki ka endike yon nouvo mekanis kote BRD4 (isoform kout) kontwole LLPS.An menm tan an, nou kwè ke idantifikasyon nan substra Parkin se yon senaryo nan ki idantifikasyon an nan adhésifs endirèk obligatwa.Nou idantifye de substra parkin ki pa idantifye epi nou konfime degradasyon yo sou wout ubiquitination-proteasome.Dènyèman, yo te devlope yon estrateji pyèj ki baze sou mekanis pou detekte substra idrolaz lè yo bloke yo ak anzim.Malgre ke sa a se yon metòd trè pwisan, li pa apwopriye pou analiz la nan substra ki enplike nan fòmasyon nan konplèks gwo epi li mande pou fòmasyon nan lyezon kovalan ant anzim la ak substra a.Nou espere ke PDPL ka pwolonje pou etidye lòt konplèks pwoteyin ak fanmi anzim, tankou fanmi deubiquitinase ak metaloprotease.
Yon nouvo fòm miniSOG, ki rele SOPP3, te devlope ak pwodiksyon oksijèn singlet amelyore.Nou konpare miniSOG ak SOPP3 epi nou jwenn amelyore pèfòmans regilye nèf semenn klas, byenke rapò siyal-a-bri rete san chanjman (figi siplemantè 11).Nou te sipoze ke optimize SOPP3 (egzanp, atravè evolisyon dirije) ta mennen nan pwoteyin fotosensibilisateur ki pi efikas ki mande pou pi kout tan limyè epi konsa pèmèt pwosesis selilè ki pi dinamik yo dwe kaptire.Miyò, vèsyon aktyèl la nan PDPL limite a sa sèlman anviwònman selilè paske li mande pou limyè ble limyè epi li pa ka antre nan tisi gwo twou san fon.Karakteristik sa a anpeche itilize li nan etid modèl bèt.Sepandan, konbinezon optogenetics ak PDPL ta ka bay yon opòtinite pou rechèch sou bèt, espesyalman nan sèvo a.Anplis de sa, lòt fotosensibilisateur enfrawouj Enjenieri tou retire limit sa a.Aktyèlman rechèch ap fèt nan domèn sa a.
Liy selilè HEK293T la te jwenn nan ATCC (CRL-3216).Liy selilè a te teste negatif pou enfeksyon mycoplasma epi yo te kiltive nan DMEM (Thermo, #C11995500BT) ki te konplete ak 10% serom fetis bovine (FBS, Vistech, #SE100-B) ak 1% penisilin/streptomycin (Hyclone, #SV30010).grandi nan.
3-Aminophenylene (echantiyon 3) ak (4-ethynylphenyl) methanamine (echantiyon 4) te achte nan men Bidepharm.Propylamine (sond 2) te achte nan men Energy-chemicals.N-(2-Aminophenyl)pent-4-ynamide (sond 1) te sentèz dapre metòd pibliye.
Tablo siplemantè 1 bay lis konstriksyon jenetik yo itilize nan etid sa a.MiniSOG ak KillerRed sekans yo te klonaj nan yon plasmid kado ki soti nan P. Zou (Peking University).Sekans vize matris mitokondriyo a te sòti nan 23 N-tèminal asid amine COX4 epi yo te klonaj nan vektè ki endike yo lè l sèvi avèk yon asanble Gibson (Beyotime, #D7010S).Pou vize manbràn ak nwayo retikul endoplasmik la, SEC61B ADN imen (NM_006808.3) (NEB, #M0491L) anplifye pa PCR ki soti nan yon bibliyotèk cDNA nan selil HEK293T, ak ADN H2B (fè don pa D. Lin, Shenzhen Bay Laboratory) ak klonaj, jan mansyone pi wo a.Sòf si yo endike otreman, lòt jèn pwoteyin yo itilize pou transfèksyon ak konstriksyon liy selil ki estab yo te PCR anplifye nan bibliyotèk cDNA selil HEK293T.G3S (GGGS) ak G4S (GGGGS) yo te itilize kòm linkers ant pwoteyin Garnier ak miniSOG.Yon etikèt epitop V5 (GKPIPNPLLGLDST) te ajoute nan konstriksyon fizyon sa yo.Pou ekspresyon nan mamifè yo ak etabli yon liy selil ki estab, yo te subklonaj konstriksyon miniSOG fizyon an nan vektè lentiviral pLX304 la.Pou ekspresyon bakteri, miniSOG te klonaj nan vektè pET21a ki make 6xHis nan C-tèminal la.
Selil HEK293T yo te simen nan 2.0 x 105 selil pou chak byen nan plak sis-pou epi yo te transfekte 24 èdtan pita ak plasmid lentiviral recombinant (2.4 μg pLX304) ak plasmid anbalaj viral (1.5 μg psPAX2 ak 1.2 μg pMD2. , #C0533), apeprè 80% fizyon.Apre transfeksyon lannwit lan, yo te chanje mwayen an epi enkube pou yon lòt 24 èdtan.Koleksyon viris la te fèt apre 24, 48 ak 72 èdtan.Anvan enfeksyon nan liy selil sib yo, yo te filtre mwayen viral la atravè yon filtè 0.8 μm (Merck, #millex-GP) ak polybrene (Solarbio, #H8761) te ajoute nan yon konsantrasyon 8 μg / ml.Apre 24 èdtan, selil yo te pèmèt yo refè lè yo chanje mwayen an.Selil yo te chwazi lè l sèvi avèk 5 μg / ml blasticidin (Solarbio, #3513-03-9) pou twa premye pasaj yo kòm yon seleksyon pi ba sevè.Lè sa a, itilize 20 μg / ml kòm yon rejim pi sevè pou twa pwochen pasaj yo.
Selil yo te simen nan chanm 12-byen (Ibidi, #81201) nan yon dansite apeprè 20,000 selil pou chak pi.Pou amelyore adezyon selil HEK293T, ajoute 50 µg/ml fibronectin (Corning, #356008) dilye nan saline tampon fosfat (PBS, Sangon, #B640435) nan 37 °C.Chanm yo te pretrete pou 1 èdtan ak Lè sa a, retire ak PBS.Apre 24 èdtan, selil yo te lave yon fwa ak PBS, enkubasyon ak 1 mM sond 3 nan solisyon fre ekilibre sèl Hanks '(HBSS, Gibco, #14025092) pou 1 èdtan nan 37 ° C, ak Lè sa a, enkubasyon ak yon LED ble (460 nm). ).) yo te iradyasyon pou 10 minit nan tanperati chanm.Apre sa, selil yo te lave de fwa ak PBS epi yo te fikse ak 4% fòmaldeyid nan PBS (Sangon, #E672002) pou 15 minit nan tanperati chanm.Yo te retire twòp fòmaldeyid nan selil fiks yo lè yo lave twa fwa ak PBS.Lè sa a, selil yo te pèmeabilize ak 0.5% Triton X-100 (Sangon, #A600198) nan PBS epi lave 3 fwa ak PBS.Lè sa a, retire chanm lan epi ajoute nan chak echantiyon 25 µl nan yon melanj reyaksyon klike ki gen 50 µM Cy3-azide (Aladdin, #C196720), 2 mM CuSO4 (Sangon, #A603008), 1 mM BTTAA (Confluore, #BDJ-4) ak 0.5 mg/ml ascorbate sodyòm (Aladdin, no. S105024) ak enkubasyon pou 30 minit nan tanperati chanm.Apre yon reyaksyon menen, selil yo te lave sis fwa ak PBS ki gen 0.05% Tween-20 (Sangon, #A600560) (PBST) ak Lè sa a, bloke ak 5% BSA (Abcone, #B24726) nan PBST pou 30 minit nan tanperati chanm.
Pou kolokalizasyon immunostaining, selil yo te enkube ak antikò prensipal dapre kondisyon ki endike yo: sourit anti-V5 tag mAb (1:500, CST, #80076), lapen anti-Hsp60 mAb (1:1000), ABclonal, #A0564), lapen poliklonal anti-kalnexin antikò (1:500, Abcam, #ab22595) oswa lapen anti-lamin A/C monoklonal antikò (1:500; CST, #2032) nan 4 °C lannwit lan.Apre yo fin lave 3 fwa ak PBST, selil yo te enkube ak antikò segondè: kabrit anti-lapen Alexa Fluor 488 (Thermo, #A11034) dilye 1:1000, kabrit anti-sourit Alexa Fluor 594 (CST, #8889) dilye 1:1000.dilution Delye nan tanperati chanm pou 30 minit.Lè sa a, selil yo te lave 3 fwa ak PBST ak counterstained ak DAPI (Thermo, # D1306) nan PBS pou 10 minit nan tanperati chanm.Apre 3 lave ak PBS, selil yo te sele nan 50% gliserin (Sangon, #A600232) nan PBS pou D.Imaj imunofluoresan yo te jwenn lè l sèvi avèk yon mikwoskòp konfokal ZEISS LSM 900 Airyscan2 ak lojisyèl ZNE 3.5.
Pou imaj fliyoresan oksijèn singlet, selil yo te lave de fwa ak tanpon Hanks HEPES anvan yo ajoute 100 nM Si-DMA nan tanpon Hanks HEPES (DOJINDO, #MT05).Apre yo fin ekspoze a limyè, selil yo te enkube nan yon enkibatè CO2 nan 37 ° C pou 45 minit.Lè sa a, selil yo te lave de fwa ak tanpon HEPES Hanks ak counterstained ak Hoechst nan tanpon HEPES Hanks pou 10 minit nan tanperati chanm ak vizyalize lè l sèvi avèk yon mikwoskòp konfokal ZEISS LSM 900., #M36008) nan tanpon HBSS ki gen kalsyòm ak mayezyòm.Apre ekspoze a limyè oswa doxorubicin (MCE, #HY-15142A), selil yo te enkubate nan yon enkibatè CO2 nan 37 ° C pou 10 minit, lave de fwa ak tanpon HBSS, ak enkubasyon ak Hoechst nan tanpon HBSS nan tanperati chanm.minit.Doxorubicin te itilize kòm yon kontwòl sond pozitif kote selil yo te trete ak 20 μM doxorubicin nan HBSS ki gen 1% BSA pou 30 min.Imaj imunofluoresan yo te jwenn lè l sèvi avèk yon mikwoskòp konfokal Zeiss LSM 900.
Selil HEK293T ki estab ki eksprime mito-miniSOG yo te simen nan yon dansite apeprè 30% nan asyèt 15 cm.Apre 48 èdtan, lè yo te rive jwenn ~ 80% konfluans, selil yo te lave yon fwa ak PBS, enkubate ak 1 mM Sond 3 nan tanpon HBSS fre nan pou 1 èdtan nan 37 ° C ak Lè sa a, eklere ak yon LED ble pou 10 minit nan chanm. tanperati..Apre sa, yo te lave selil yo de fwa ak PBS, grate epi yo te sispann sispann nan tanpon PBS ki frèt ki gen EDTA-gratis inibitè proteaz (MCE, #HY-K0011).Selil yo te lysed pa soniting pwent an pou 1 minit (1 segonn sou ak 1 segonn koupe nan 35% anplitid).Melanj ki kapab lakòz yo te santrifuje nan 15,871 xg pou 10 min nan 4 ° C pou retire debri, epi yo te ajiste konsantrasyon an supernatant a 4 mg / mL lè l sèvi avèk yon twous tès pwoteyin BCA (Beyotime, #P0009).Konbine 1 ml lisat ki anwo a ak 0.1 mM fotodégradables azid biotin (Confluore, #BBBD-14), 1 mM TCEP (Sangon, #A600974), 0.1 mM TBTA ligand (Aladdin, #T162437), ak 1 mM enkibatè CuSO4 anba. wotasyon moute pou 1 èdtan nan tanperati chanm.Apre yon reyaksyon menen, ajoute melanj lan nan solisyon an pre-melanje (MeOH:CHCl3:H2O = 4 ml:1 ml:3 ml) nan yon flakon vè 10 ml.Echantiyon yo te melanje ak santrifuje nan 4500 g pou 10 minit nan tanperati chanm.Solisyon pi ba yo ak anwo yo te jete, presipite a te lave de fwa ak 1 ml metanol ak santrifuje nan 15871 × g pou 5 min nan 4 ° C.Ajoute 1 ml 8 M ure (Aladdin, no U111902) nan bikabonat amonyòm 25 mM (ABC, Aladdin, no A110539) pou fonn presipite a.Echantiyon yo te rekonstitye ak 10 mM dithiothreitol (Sangon, # A100281 nan 25 mM ABC) pou 40 minit nan 55 ° C ki te swiv pa adisyon a nan 15 mM iodoacetamide fre (Sangon, # A600539) nan tanperati chanm nan fè nwa a.Alkylation nan 30 minit..Yo te ajoute yon lòt 5 mM dithiothreitol pou sispann reyaksyon an.Prepare apeprè 100 µl pèl agaroz NeutrAvidin (Thermo, #29202) pou chak echantiyon lè w lave 3 fwa ak 1 ml PBS.Solisyon proteome pi wo a te dilye ak 5 ml PBS epi enkube ak pèl agarose NeutrAvidin pre-lave pou 4 èdtan nan tanperati chanm.Lè sa a, pèl yo te lave 3 fwa ak 5 ml PBS ki gen 0.2% SDS (Sangon, #A600485), 3 fwa ak 5 ml PBS ki gen 1M ure, ak 3 fwa ak 5 ml ddH2O.Lè sa a, pèl yo te rekòlte pa santrifujasyon ak resuspended nan 200 μl nan 25 mM ABC ki gen 1 M ure, 1 mM CaCl 2 (Macklin, # C805228) ak 20 ng / μl trypsin (Promega, # V5280).Trypsinize lannwit lan nan 37 ° C ak wotasyon.Reyaksyon an te sispann lè w ajoute asid fòmik (Thermo, # A117-50) jiskaske pH la rive nan 2-3.Pèl yo te lave 3 fwa ak 1 ml PBS ki gen 0.2% SDS, 3 fwa ak 1 ml PBS ki gen 1 M ure, ak Lè sa a, 3 fwa ak 1 ml dlo distile.Peptides modifye yo te libere pa lysis limyè (365 nm) pou 90 min lè l sèvi avèk 200 μl nan 70% MeOH.Apre santrifugasyon, yo te kolekte supernatant la.Lè sa a, pèl yo te lave yon fwa ak 100 μl nan 70% MeOH ak supernatant yo te pisin.Echantiyon yo te cheche nan yon konsantratè vakyòm Speedvac epi estoke nan -20 ° C jiskaske analiz.
Pou idantifye ak quantifier peptides modifye oksijèn singlet, echantiyon yo te redissoud nan 0.1% asid fòmik ak 1 μg nan peptides yo te analize lè l sèvi avèk yon espektromèt mas Orbitrap Fusion Lumos Tribrid ekipe ak yon sous ESI nano soti nan Tune ak Xcalibur soti nan lojisyèl vandè 4.3.Echantiyon yo te separe sou yon kolòn kapilè 75 µm × 15 cm anndan chaje ak materyèl 3 µm C18 (ReproSil-pur, #r13.b9.) epi konekte ak yon sistèm EASY-nLC 1200 UHPLC (Thermo).Peptides yo te separe pa lineyè 95 minit chromatografi gradyan soti nan 8% sòlvan B a 50% sòlvan B (A = 0.1% asid fòmik nan dlo, B = 0.1% asid fòmik nan 80% acetonitrile), Lè sa a, lineyèman ogmante a 98% B min. nan 6 min nan yon pousantaj koule nan 300 nl / min.Orbitrap Fusion Lumos kolekte done altènativman ant eskanè konplè MS ak eskanè MS2 depann sou done yo.Yo te mete vòltaj la sputtering a 2.1 kV ak tanperati a nan kapilè transpò iyon an te 320 ° C.MS spectre (350-2000 m/z) yo te kolekte ak yon rezolisyon 120,000, AGC 4 × 105, ak yon tan maksimòm opinyon 150 ms.10 prekursè ki pi souvan chaje miltipliye yo nan chak eskanè konplè yo te fragmenté lè l sèvi avèk HCD ak yon enèji kolizyon nòmalize nan 30%, yon fenèt izolasyon quadrupol nan 1.6 m/z, ak yon anviwònman rezolisyon 30,000.Yon sib AGC pou spèktrometri mas tandem lè l sèvi avèk 5 × 104 ak tan maksimòm opinyon 150 ms.Eksepsyon dinamik yo mete sou 30 segonn. Yo te rejte iyon ki pa asiyen oswa sa yo ki gen yon chaj 1+ ak >7+ pou MS/MS. Yo te rejte iyon ki pa asiyen oswa sa yo ki gen yon chaj 1+ ak >7+ pou MS/MS. Неназначенные ионы или ионы с зарядом 1+ и >7+ были отклонены для МС/МС. Yo te rejte iyon ki pa asiyen oswa iyon ki gen yon chaj 1+ ak >7+ pou MS/MS.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。 Неуказанные ионы или ионы с зарядами 1+ и >7+ были отклонены для МС/МС. Yo te rejte iyon ki pa espesifye oswa iyon ak chaj 1+ ak > 7+ pou MS/MS.
Done kri yo trete lè l sèvi avèk platfòm enfòmatik FragPipe ki baze sou MSFragger.Patipri mas ak asid amine ki koresponn yo te detèmine lè l sèvi avèk yon algorithm rechèch ouvè ak yon tolerans mas précurseur nan -150 a 500 Da.Lè sa a, peptides modifye yo te idantifye lè l sèvi avèk modifikasyon histidine ak pwogrè mas nan + 229.0964 ak + 247.1069 Da nan PD (Proteome Discoverer 2.5, Thermo).
Selil ki estab ki eksprime jèn miniSOG la te plake nan asyèt 6 cm.Lè yo rive nan ~ 80% konfluans, selil yo te lave yon fwa ak HBSS (Gibco, #14025092), Lè sa a, enkubate ak sond chimik nan HBSS pou 1 èdtan nan 37 ° C ak eklere ak limyè ble.10W dirije pou 20 minit nan tanperati chanm.Pou detèmine ki kalite espès oksijèn reyaktif ki enplike nan PDPL, 0.5 mM vitamin C (MCE, #HY-B0166), 5 mM Trolox (MCE, #HY-101445), D2O (Sigma, #7789-20-0), 100 mM mannitol (Enèji chimik, #69-65-8), 100 μM H2O2, 10 mM NaN3 yo te ajoute nan selil yo kòm sipleman.Apre lave ak PBS frèt, selil yo te grate, kolekte nan tib santrifij 1.5 ml, ak sonike ak yon pwent pou 1 min nan 200 μl nan PBS ak 1x inibitè proteaz san EDTA (1 s ak 1 s san yo pa, anplitid 35%).Melanj ki kapab lakòz yo te santrifuje nan 15,871 × g pou 10 min nan 4 °C epi yo te ajiste konsantrasyon an supernatant a 1 mg / mL lè l sèvi avèk yon twous tès pwoteyin BCA.Apeprè 50 µl nan lisat ki anwo a te enkube ak 0.1 mM rhodamine azide (Aladdin, No. T131368), 1 mM TCEP, 0.1 mM TBTA ligand, ak 1 mM CuSO4 pou 1 èdtan nan tanperati chanm ak wotasyon anba nan tèt.Apre reyaksyon klike la, presipitasyon ak asetòn te pote soti lè w ajoute 250 μl asetòn pre-refwadi nan echantiyon yo, enkubasyon nan -20 ° C pou 20 min ak santrifuje nan 6010 × g pou 10 min nan 4 ° C.Kolekte granules a epi bouyi nan 50 µl tanpon 1x Laemmli a pou 10 min nan 95 °C.Lè sa a, echantiyon yo te analize sou jèl long SDS-PAGE epi yo te vizyalize lè l sèvi avèk Bio-rad ChemiDoc MP Touch D 'sistèm ak lojisyèl Image Lab Touch.
Ekspresyon ak pirifikasyon nan pwoteyin recombinant miniSOG-6xHis te fèt jan sa dekri deja.Yon ti tan, E. coli BL21 (DE3) selil (TransGen, # CD701-02) yo te transfòme ak pET21a-miniSOG-6xHis ak ekspresyon pwoteyin te pwovoke ak 0.5 mM IPTG (Sangon, #A600168).Apre liz selil, pwoteyin yo te pirifye lè l sèvi avèk pèl agaroz Ni-NTA (MCE, no 70666), dyalize kont PBS, epi estoke nan -80 ° C.
Pou yon tès pwoksimite etikèt in vitro ki baze sou antikò, melanje 100 μM miniSOG pirifye, 1 mM pwofonde 3, ak 1 μg antikò antikò sourit monoklonal (TransGen, #HT501-01) nan PBS nan yon volim reyaksyon total de 50 μl..Te melanj reyaksyon an iradyasyon ak limyè ki ap dirije ble pou 0, 2, 5, 10, ak 20 min nan tanperati chanm.Yo te enkube melanj lan ak 0.1 mM biotin-PEG3-azide (Aladdin, #B122225), 1 mM TCEP, 0.1 mM TBTA ligand, ak 1 mM CuSO4 pou 1 h nan tanperati chanm sou yon shaker mouvman anlè.Apre yon reyaksyon menen, ajoute 4x tanpon Laemmli a dirèkteman nan melanj lan epi bouyi nan 95 ° C pou 10 min.Echantiyon yo te analize sou jèl SDS-PAGE ak analize pa Western blotting ak streptavidin-HRP (1:1000, Solarbio, #SE068).
Yo te itilize yon peptide sentetik ki gen histidin ak amidasyon C-tèminal (LHDALDAK-CONH2) pou analize etikèt in vitro ki baze sou peptide ki tou pre.Nan tès sa a, 100 μM pirifye miniSOG, 10 mM pwofonde 3 ak 2 μg / ml peptide sentetik yo te melanje nan PBS nan yon volim reyaksyon total de 50 μl.Te melanj reyaksyon an iradyasyon ak limyè ki ap dirije ble pou 1 èdtan nan tanperati chanm.Yo te analize yon mikrolit echantiyon lè l sèvi avèk yon sistèm LC-MS (Waters, SYNAPT XS Iyon Mobilite espektwomèt mas Tan-of-Vòl ak lojisyèl analiz spectre MassLynx).
Selil HEK293T ki estab ki eksprime jèn fizyon miniSOG yo te simen nan asyèt 10 cm pou liy ki gen diferan lokalizasyon òganèl (Mito, ER, Nucleus) ak asyèt 15 cm pou liy Parkin-miniSOG ak BRD4-miniSOG.Lè yo rive nan ~ 90% konfluans, selil yo te lave yon fwa ak HBSS, Lè sa a, enkubasyon ak sond 3 nan HBSS pou 1 èdtan nan 37 ° C ak eklere ak yon LED 10 W ble nan tanperati chanm.Pou etikèt ki pa kontakte Parkin, yo te ajoute 10 µM proton carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone CCCP (Solarbio, #C6700) ak sond 3 nan HBSS pou 1 èdtan nan 37 °C.Liz selil, klike sou chimi, rediksyon ak etap alkilasyon yo te menm jan sa dekri pi wo a, eksepte ke yo te ajoute 2 mg lysate epi yo te itilize biotin PEG3 azid nan reyaksyon klike la olye pou yo fotodegradab biotin azid.Apre anrichisman, pèl yo te lave 3 fwa ak 5 ml PBS ki gen 0.2% SDS, 3 fwa ak 5 ml PBS ki gen 1 M ure, ak 3 fwa ak 5 ml PBS.Apre sa, yo te ajoute 2 µg trypsin nan 300 µl 25 mM ABC ki gen 1 M ure pou koupe pwoteyin lan lannwit lan nan 37°C.Yo te sispann reyaksyon an lè yo ajoute asid fòmik jiskaske yo te rive jwenn yon pH 2-3.Apre tripsinizasyon sou pèl, yo te desale solisyon peptide a lè l sèvi avèk yon kolòn SOLAµ HRP (Thermo, #60209-001) epi yo te seche nan yon konsantratè vakyòm Speedvac.Peptides yo te redissoud nan 0.1% asid fòmik ak 500 ng nan peptides yo te analize lè l sèvi avèk yon espektromèt mas Orbitrap Fusion Lumos Tribrid ekipe ak sous nano-ESI ki dekri pi wo a.Peptides yo te separe sou prekolòn komèsyal RP-HPLC (75 μm x 2 cm) (Thermo, pa gen 164946) ak analyse kolòn RP-HPLC (75 μm x 25 cm) (Thermo, pa gen okenn 164941), tou de plen ak 2 μm.gradyan soti nan 8% a 35% ACN nan 60 minit, Lè sa a, lineyèman ogmante a 98% B nan 6 minit nan yon pousantaj koule nan 300 Nl / min.MS spectre (350-1500 m/z) yo te kolekte ak yon rezolisyon 60,000, AGC 4 × 105, ak yon tan opinyon maksimòm 50 ms.Iyon chwazi yo te sekans fragmenté pa HCD nan sik 3 s ak yon enèji kolizyon nòmalize nan 30%, yon fenèt izolasyon quadrupole nan 1.6 m / z, ak yon rezolisyon nan 15000. Yon 5 × 104 tandem mas spectrometer sib AGC ak yon tan maksimòm piki. nan 22 ms yo te itilize.Esklizyon dinamik yo mete sou 45 segonn. Yo te rejte iyon ki pa asiyen oswa sa yo ki gen yon chaj 1+ ak >7+ pou MS/MS. Yo te rejte iyon ki pa asiyen oswa sa yo ki gen yon chaj 1+ ak >7+ pou MS/MS. Неназначенные ионы или ионы с зарядом 1+ и >7+ были отклонены для МС/МС. Yo te rejte iyon ki pa asiyen oswa iyon ki gen yon chaj 1+ ak >7+ pou MS/MS.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。 Неуказанные ионы или ионы с зарядами 1+ и >7+ были отклонены для МС/МС. Yo te rejte iyon ki pa espesifye oswa iyon ak chaj 1+ ak > 7+ pou MS/MS.
Etap preparasyon echantiyon yo jiska anrichisman pèl NeutrAvidin yo te menm jan ak analiz LC-MS/MS ki dekri pi wo a.Apeprè 50 μg lysate te itilize kòm opinyon pou kontwòl loading ak 2 mg lysate te itilize pou reyaksyon klike sou.Apre anrichisman ak lave ak neutravidin, pwoteyin yo mare yo te eluye lè yo ajoute 50 μl nan tanpon Laemmli a nan pèl yo résine agarose ak bouyi nan 95 ° C pou 5 minit.Kontwòl chaj D 'ak chaplèt anrichi echantiyon yo te analize pa SDS-PAGE ak transfere nan manbràn PVDF (Millipore, #ISEQ00010) pa metòd estanda Western blot.Manbràn yo te bloke ak 5% lèt ekreme (Sangon, #A600669) nan TBS ki gen 0.1% tween-20 (TBST) ak enkubasyon sekans ak antikò prensipal ak segondè.Antikò prensipal yo te dilye 1:1000 nan 5% lèt ekreme nan TBST epi yo te enkube lannwit lan nan 4 ° C.Antikò segondè yo te itilize nan yon rapò 1:5000 ak enkubasyon pou 1 èdtan nan tanperati chanm.Manbràn yo te vizyalize pa chemiluminescence lè l sèvi avèk sistèm nan D Chemidoc MP.Tout analiz ki pa koupe nan tach ak jèl nan figi a yo prezante kòm done anvan tout koreksyon.
Antikò prensipal yo itilize nan etid sa a enkli antikò monoklonal lapen anti-SFPQ (CST, pa gen 71992), antikò monoklonal lapen anti-FUS (CST, pa gen 67840), antikò poliklonal lapen anti-NSUN2 (Proteintech, pa gen 20854-1-). AP), antikò poliklonal lapen anti-mSin3A (Abcam, #ab3479), antikò monoklonal sourit anti-tag (TransGen, #HT201-02), antikò monoklonal sourit anti-β-actin (TransGen, #HC201-01), antikò lapen -CDK2 monoklonal antikò (ABclonal, #A0094), lapen monoklonal antikò pou CTBP1 (ABclonal, #A11600), lapen poliklonal antikò DUT (ABclonal, #A2901), lapen poliklonal antikò pou PSMC4 (ABclonal, #A2505), lapen anti- DNAJB1 poliklonal antikò (ABclonal, # A5504).Antikò sa yo te itilize nan yon dilution 1:1000 nan 5% lèt ekreme nan TBST.Antikò segondè yo itilize nan etid sa a enkli IgG anti-lapen (TransGen, #HS101-01), IgG anti-sourit (TransGen, #HS201-01) nan yon dilution 1:5000.
Pou plis envestige si BRD4 reyaji ak SFPQ, ki estab HEK293T ak BRD4-miniSOG selil overexpressing HEK293T yo te plake nan asyèt 10 cm.Selil yo te lave ak PBS frèt ak lysed nan 1 ml Pierce IP lysis tanpon (Thermo Fisher, #87787) ak EDTA-gratis inibitè proteaz pou 30 minit nan 4 ° C.Apre sa, lysates yo te kolekte nan 1.5 ml tib santrifujeur ak santrifuje nan 15,871 xg pou 10 min nan 4 ° C.Sipènatant la te rekòlte epi enkube ak 5 µg antikò monoklonal sourit ki make anti-V5 (CST, #80076) lannwit lan nan 4°C.Lave apeprè 50 µl pèl mayetik pwoteyin A/G (MCE, #HY-K0202) de fwa ak PBS ki gen 0.5% Tween-20.Lè sa a, lysate selil yo te enkube ak pèl mayetik pou 4 èdtan nan 4 ° C ak wotasyon anba nan tèt.Lè sa a, pèl yo te lave kat fwa ak 1 ml nan tanpon PBST ak bouyi nan 95 ° C pou 5 min.Echantiyon yo te analize sou jèl SDS-PAGE epi yo te transfere nan manbràn PVDF lè l sèvi avèk metòd Western blot estanda.Manbràn yo te bloke nan 5% lèt ekreme nan TBST ak enkubasyon sekans ak antikò prensipal ak segondè.Antikò Monoklonal Antikò Primè Anti-SFPQ lapen (CST, #71992) te itilize nan yon rapò 1:1000 nan 5% lèt ekreme nan TBST ak enkubasyon lannwit lan nan 4 ° C.Anti-lapen IgG te itilize nan yon rapò de 1:5000 ak enkubasyon pou 1 èdtan nan tanperati chanm.Manbràn yo te vizyalize pa chemiluminescence lè l sèvi avèk sistèm nan D Chemidoc MP.
Tout estrikti yo te itilize pou analiz zòn Solvant Aksesib Sifas (SASA) yo te jwenn nan Pwoteyin Done Bank (PDB)52 oswa AlphaFold Pwoteyin Estrikti Database53.Yo te kalkile SASA absoli pou chak rezidi lè l sèvi avèk pwogram FreeSASA.Se sèlman done SASA konplè epi san anbigwi pou histidine ki make ak vwazen li yo te itilize pou jwenn SASA mwayèn pou chak estrikti.Aksèbilite relatif sòlvan (RSA) pou chak histidine te kalkile lè w divize valè absoli SASA pa zòn sifas maksimòm anpirik posib rezidi ki disponib pou sòlvan an.Lè sa a, tout histidine yo te klase kòm kache si RSA an mwayèn te anba a 20%, otreman ekspoze56.
Fichye kri yo te jwenn nan mòd DDA yo te itilize Proteome Discoverer (v2.5) oswa MSfragger (Fragpipe v15.0) nan baz done ki apwopriye SwissProt pwoteyin ki gen kontaminan komen.Peptides yo mande trypsin konplè ak de sit klivaj ki manke, methylation carbamoyl kòm yon modifikasyon fiks ak oksidasyon methionine kòm yon modifikasyon dinamik.Tolerans pwa précurseur ak fragman yo te fikse a 10 ppm ak 0.02 Da (MS2 Orbitrap), respektivman. Yo te retire frape kontamine yo, epi yo te filtre pwoteyin pou jwenn yon to dekouvèt fo <1%. Yo te retire frape kontamine yo, epi yo te filtre pwoteyin pou jwenn yon to dekouvèt fo <1%. Попадания загрязняющих веществ были удалены, а белки отфильтрованы, чтобы полуфи полуфи 1%. Yo te retire frape kontamine yo epi yo te filtre pwoteyin pou bay yon to deteksyon fo <1%.去除污染物命中，过滤蛋白质以获得<1%的错误发现率。 <1%的错误发现率。 Попадания загрязняющих веществ были удалены, а белки отфильтрованы для достижеств были удалены, а белки отфильтрованы для достижения 1%. Yo te retire frape kontamine yo epi yo te filtre pwoteyin pou reyalize yon pousantaj fo pozitif nan <1%.Pou analiz quantitative san yo pa itilize etikèt, yo te itilize kontni pwoteyin nòmal nan twa repete byolojik.Yo te fè analiz lokalizasyon subselilè pwoteyin lè l sèvi avèk analiz Gene Ontology (GO) ki soti nan DAVID Bioinformatics Resources, MitoCarta 3.0 ak baz done konpile ak pibliye pa gwoup la Alice Ting.Kat vòlkan an te jwenn nan Perseus (v1.6.15.0). Chanjman nan pliye abondans pwoteyin yo te teste pou siyifikasyon estatistik lè l sèvi avèk yon tès t de bò, ak frape pwoteyin yo te idantifye ak chanjman abondans> 2 (sòf si otreman endike) ak valè p <0.05. Chanjman nan pliye abondans pwoteyin yo te teste pou siyifikasyon estatistik lè l sèvi avèk yon tès t de bò, ak frape pwoteyin yo te idantifye ak chanjman abondans> 2 (sòf si otreman endike) ak valè p <0.05. Изменения кратности содержания белка были проверены на статистическую значимость с использованием двустороннего t-критерия, и совпадения белков были идентифицированы с изменением содержания> 2 (если не указано иное) и значением p <0,05. Chanjman pliye kontni pwoteyin yo te teste pou siyifikasyon estatistik lè l sèvi avèk yon tès t de-ke, ak alimèt pwoteyin yo te idantifye ak chanjman kontni> 2 (sòf si otreman te note) ak valè ap <0.05.双边 双边 检验 蛋白质 丰度 倍数 的 统计 显着性 ， 并 确定 蛋白质 中 的 丰度 变化 变化 变化 变化 变化 变化 变化 变化 变化 变化 变化双边 双边 检验 蛋白质 倍 变化 的 统计 显着性 并 确定 蛋白质 命 的 丰度 变化 变化 变化 变化 变化 的 的 的 的 的 Статистическую значимость кратных изменений содержания белка проверяли с использованием двустороннего t-критерия, а совпадения белков определяли для изменений содержания >2 (если не указано иное) и p-значений <0,05. Siyifikasyon estatistik chanjman pli nan kontni pwoteyin yo te teste lè l sèvi avèk yon tès t-de-tail, ak alimèt pwoteyin yo te detèmine pou chanjman kontni> 2 (sòf si otreman endike) ak p-valè <0.05.Yo te fè analiz entèraksyon pwoteyin lè l sèvi avèk analiz GO ansanm ak baz done a String.
Twa replike byolojik yo te pote ak rezilta menm jan an.Analiz estatistik yo te fè ak GraphPad Prism (lojisyèl GraphPad) ak simityè vòlkan yo te pwodwi ak Perseus (v1.6.15.0).Pou konpare de gwoup yo, yo te detèmine p-valè yo lè l sèvi avèk yon tès t Student de-ke.Se sèlman pwoteyin singleton idantifye omwen de fwa nan gwoup eksperimantal la te enkli nan simityè vòlkan yo, ak valè ki korespondan ki manke nan gwoup kontwòl la te ranplase ak Perseus ki soti nan yon distribisyon nòmal pou yo ka kalkile valè p la.Ba erè reprezante mwayèn ± devyasyon estanda.Nan analiz pwoteomik pou analiz estatistik, yo te kenbe abondans pwoteyin ki te parèt nan omwen de replike byolojik.Metòd estatistik yo pa te itilize pou pre-detèmine gwosè echantiyon an.Eksperyans yo pa o aza.Chèchè yo pa t avèg pou travay yo pandan eksperyans ak evalyasyon rezilta yo.
Pou plis enfòmasyon sou konsepsyon etid, gade abstrè Rapò rechèch la nati ki lye nan atik sa a.
Done espektometri mas yo te jwenn nan etid sa a te soumèt bay ProteomeXchange Consortium atravè depo patnè iProX57 anba idantite done PXD034811 (PDPL-MS dataset).Done kri yo bay sou fòm dosye done kri.Atik sa a bay done orijinal yo.
Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Lè w konnen katye a: lè l sèvi avèk biotinilation ki depann de pwoksimite pou karakterize konplèks pwoteyin ak òganèl kat. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Lè w konnen katye a: lè l sèvi avèk biotinilation ki depann de pwoksimite pou karakterize konplèks pwoteyin ak òganèl kat.Gingras, AS, Abe, KT ak Raut, B. Abitye ak anviwònman: lè l sèvi avèk biotinilation pwoksimite-depandan pou karakterize konplèks pwoteyin ak òganèl kat jeyografik. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Konprann katye a: sèvi ak depandans katye a sou lavi byolojik.Gingras, AS, Abe, KT ak Raut, B. Konpreyansyon pwoksimite: karakterizasyon konplèks pwoteyin ak kat òganèl lè l sèvi avèk biotinilation pwoksimite-depandan.Kouran.Opinyon mwen.Chimik.byoloji 48, 44–54 (2019).
Geri, JB et al.Map fè mikwo-anviwònman an lè w transfere enèji Dexter nan selil iminitè yo.Syans 367, 1091–1097 (2020).
Hertling, EL et al.Rezo echèl de-proteome detekte renouvèlman espesifik selil entèatomi imen an.Selil 184, 3022–3040.e3028 (2021).
Tan pòs: 15-Sep 2022
