Nouvèl

Mèsi paske w vizite Nature.com.Vèsyon navigatè w ap itilize a gen sipò CSS limite.Pou pi bon eksperyans, nou rekòmande pou w sèvi ak yon navigatè ki ajou (oswa enfim mòd konpatibilite nan Internet Explorer).Antretan, pou asire sipò kontinye, nou pral rann sit la san estil ak JavaScript.
Selil kansè yo te evolye divès mekanis pou simonte estrès selilè epi kontinye pwogrese.Pwoteyin kinaz R (PKR) ak activator pwoteyin li yo (PACT) se premye sekouris yo ki kontwole plizyè siyal estrès ki mennen nan anpèchman pwopagasyon selil ak apoptoz.Sepandan, règleman an nan chemen PACT-PKR nan selil kansè yo rete lajman enkoni.Isit la, nou te jwenn ke long ki pa kodaj RNA (lncRNA) aspartyl tRNA synthetase antisense RNA 1 (DARS-AS1) se dirèkteman patisipe nan anpèchman nan chemen PACT-PKR la ak ankouraje pwopagasyon selil kansè yo.Sèvi ak tès depistaj fonksyonèl gwo echèl nan CRISPRi 971 kansè-asosye lncRNA, nou te jwenn ke DARS-AS1 te asosye ak anpil amelyore pwopagasyon selil kansè yo.Se poutèt sa, DARS-AS1 knockout inibit pwopagasyon selil ak fè pwomosyon apoptoz selil kansè nan plizyè liy selil kansè nan vitro ak siyifikativman diminye kwasans timè nan vivo.Mekanikman, DARS-AS1 mare dirèkteman nan domèn aktivasyon PACT epi anpeche entèraksyon PACT-PKR, kidonk diminye deklanchman PKR, fosforilasyon eIF2α, ak anpeche lanmò selil apoptotik.Klinikman, DARS-AS1 eksprime anpil nan plizyè kansè, ak ekspresyon lncRNA sa a montre yon move pronostik.Etid sa a elicide règleman espesifik kansè nan chemen PACT-PKR pa DARS-AS1 lncRNA epi li bay yon lòt sib pou pronostik kansè ak tretman.
Kapasite pou adapte yo ak estrès se yon karakteristik enpòtan nan siviv selil kansè ak pwopagasyon.Pwopagasyon rapid ak karakteristik metabolik kansè nan pik nan mikwo-anviwònman piman bouk—privasyon eleman nitritif, ipoksi, ak pH ba—ki ka deklanche chemen siyal lanmò selil yo.Disregulation nan jèn estrès-sansib tankou p535, pwoteyin chòk chalè 6, 7, KRAS8, 9, ak HIF-110, 11, 12, 13 souvan obsève nan kansè, kidonk bloke apoptoz ak ankouraje siviv.
Pwoteyin kinaz R (PKR) se yon Capteur estrès enpòtan ak subunit kinase nan faktè inisyasyon ekaryotik 2α (eIF2α), yon regilatè tradiksyon ki lye estrès selilè ak lanmò selil.PKR te orijinal idantifye kòm yon pwoteyin antiviral pa deteksyon an nan yon etranje doub-stranded RNA (dsRNA).Lè yo fin aktive, PKR fosforil eIF2α pou anpeche sentèz pwoteyin viral ak selilè14,15,16.PACT (PKR activator protein) te idantifye kòm premye pwoteyin activator PKR nan absans dsRNA17,18,19,20,21,22,23.Atravè entèraksyon dirèk ak PKR, PACT transdui divès kalite estrès (grangou serom, oksijene oswa tretman asenit) nan PKR ak chemen siyal en.Anplis fosforilasyon eIF2α, deklanchman PKR PACT-medyatè deklannche divès evènman ki asosye ak repons estrès, ki gen ladan estati redox chanje atravè chemen PI3K/Akt24, amelyore domaj ADN tcheke atravè p5325,26 ak NF-κB27,28 Regle transkripsyon, 29. Etandone wòl kritik yo nan repons estrès, pwopagasyon, apoptoz ak lòt pwosesis selilè kle, PKR ak PACT pwomèt objektif terapetik pou anpil maladi, espesyalman kansè30,31,32,33.Sepandan, malgre siyifikasyon fonksyonèl ak byolojik pleyotropik sa a, règleman aktivite PACT/PKR nan selil kansè yo rete flotant.
lncRNA yo se transkripsyon ki pi gwo pase 200 nukleotid ki pa gen okenn potansyèl kodaj pwoteyin.Depi dènye pwojè sekans genomic antye te idantifye dè milye de lncRNAs,35,36 anpil efò yo te fè pou elicide fonksyon byolojik yo.Yon gwoup rechèch k ap grandi te montre ke lncRNA yo patisipe nan anpil pwosesis byolojik37 ki gen ladan règleman an nan inaktivasyon X-kwomozòm38,39, imprinting40, transcription41,42, tradiksyon43 e menm kwasans kansè44,45,46,47.Etid sa yo rapòte ke anpil lncRNA yo patisipe nan chemen PACT/PKR.Yon etid sa yo te montre ke lncRNA ASPACT inibit transkripsyon PACT ak ogmante retansyon nikleyè nan PACT mRNA.Lòt etid yo montre ke lncRNA nc886 mare ak PKR epi li anpeche fosforilasyon li yo49,50.Jiskaprezan, lncRNA reglemante PACT-medyatè aktivasyon PKR pa te rapòte.
Aspartyl-tRNA synthetase antisense RNA 1 (DARS-AS1) te idantifye kòm yon onkogenic lncRNA51,52,53,54.Atravè règleman miP-194-5p53, miP-12952 ak miP-532-3p51, yo montre DARS-AS1 pou ankouraje kwasans selil klè nan selil ren, tiwoyid ak poumon ki pa ti selil, respektivman.Tong ak kòlèg li yo te jwenn tou ke DARS-AS1 ankouraje pwogresyon myeloma pa kenbe estabilite nan pwoteyin 39 (RBM39) RNA-obligatwa motif.Sepandan, pa gen okenn etid yo te fèt sou si wi ou non lncRNA sa a patisipe nan règleman an nan deklanchman PACT-PKR ak repons nan estrès nan selil kansè yo.
Isit la, nou te fè yon ekran pèt fonksyon gwo echèl lè l sèvi avèk sistèm CRISPRi a epi detèmine ke DARS-AS1 lncRNA ankouraje pwopagasyon plizyè kalite selil kansè yo.Anplis de sa, nou te idantifye yon mekanis pi gwo: DARS-AS1 mare dirèkteman nan PACT, anpeche PACT ak PKR obligatwa, anpeche fosforilasyon eIF2α, yon substra PKR ki pi ba, epi finalman anpeche lanmò selil apoptotik.An konklizyon, travay nou an revele lncRNA DARS-AS1 kòm yon regilatè nan chemen PACT-PKR ak yon sib potansyèl pou tretman kansè ak pronostik.
Anpil etid jenomik pwofil te idantifye dè santèn de lncRNA ki asosye ak kansè.Sepandan, fonksyon yo rete lajman enkoni56.Pou idantifye kandida lncRNA pwomèt ki enplike nan pwogresyon kansè, nou te fè yon ekran pèt fonksyon pou diminye pwopagasyon nan liy selil kansè kolorektal SW620 lè l sèvi avèk sistèm CRISPRi (Fig. 1a).Karakteristik inik nan liy selil kansè nan kolon SW480 ak SW620 se ke yo sòti nan timè prensipal ak segondè nan yon sèl pasyan.Sa a bay yon konparezon valab pou etidye chanjman jenetik nan pwogresyon kansè nan kolon avanse.Se poutèt sa, nou analize transcriptom yo nan liy selil kansè kolorektal yo (SW480 ak SW620) lè l sèvi avèk sekans RNA ak kolekte kèk lncRNAs potansyèl fonksyonèl nan literati a pibliye.Dapre rezilta sa yo, nou te fèt yon bibliyotèk sgRNA ki gen 7355 oligos sgRNA ki vize 971 lncRNA ki asosye ak kansè ak 500 oligos sgRNA ki pa vize pou yon kontwòl negatif (Done siplemantè 1).
Reprezantasyon eskematik tès depistaj lè l sèvi avèk sistèm CRISPRi la.b sgRNA anrichisman apre tès depistaj.Liy pwenti orizontal la reprezante log2 (chanjman pliye) = ±0.58.Liy pwenti vètikal la endike valè p = 0.05.Pwen nwa reprezante sgRNA ki pa sib (deziyen kòm NC).Pwen wouj yo se sgRNA ki vize DARS-AS1.Pwen ble yo se sgRNA ki vize LINC00205, yon lncRNA onkogenik ki te dekri deja.pliye chanjman = (lekti nòmalize, jou 17)/(lekti nòmalize, jou 0).c Knockdown sgRNA DARS-AS1 anpeche kwasans selil yo.Ba erè reprezante ± devyasyon estanda nan twa eksperyans yo.* p ≤ 0.05, ** p ≤ 0.01 Egzamen t Elèv de-ke.d ekspresyon DARS-AS1 nan timè (TCGA dataset).em Ekspresyon DARS-AS1 nan pè echantiyon nòmal ak timè nan pasyan ki gen BLCA, KIRC, PRAD, LUSC, UCEC, LUAD, LIHC, KIRP, ak COAD, respektivman (TCGA dataset).P-valè yo te jwenn lè l sèvi avèk pè tès t Elèv la.
Apre konstwi plasmid la ak anbalaj lentiviris la, nou transdui liy selil kansè kolorektal dCas9-SW620 ak bibliyotèk ki anwo a nan kat eksperyans enfeksyon endepandan.Plitisite enfeksyon (MOI) pou enfeksyon sa yo te 0.1-0.3, sa ki endike ke chak selil ka sèlman transfekte ak yon sèl sgRNA.Apre 18 jou nan kilti in vitro, pwofil anrichisman sgRNAs sib la diminye oswa ogmante apre tès depistaj, pandan y ap kantite oligonukleotid kontwòl ki pa vize rete relativman chanje konpare ak pwofil pre-depistaj la, ki endike ke sib nou an gen yon ekran trè espesifik. bibliyotèk.Diri.1b ak tablo siplemantè 1). LINC00205, ki te deja rapòte pou ankouraje kansè nan poumon ak pwogresyon kansè nan fwa58,59,60, te depistaj soti (log2 (foldchange) <-0.58, p valè <0.05), konfime fyab nan tès depistaj sa a (Fig. 1b). LINC00205, ki te deja rapòte pou ankouraje kansè nan poumon ak pwogresyon kansè nan fwa58,59,60, te depistaj soti (log2 (foldchange) <-0.58, p valè <0.05), konfime fyab nan tès depistaj sa a (Fig. 1b). LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию рака легких и рака печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, значение p <0,05), что подтверждает надежность этого скрининга (рис . 1b). LINC00205, te deja rapòte pou ankouraje pwogresyon kansè nan poumon ak kansè nan fwa58,59,60, te eskli (log2 (pliye chanjman) <-0.58, p-valè <0.05), konfime solidite tès depistaj sa a (Fig. .1b) . Linc00205 之前 被 报道 促进 肺癌 和 肝癌 进展 58,59,60 ， 被 选 掉 （log2 （倍数 变化） <-0.58 ， P 值 <0.05） ， 证实 该 Linc00205 之前 被 报道 促进 肺癌 和 肝癌 进展 58,59,60 ， 被 选 掉 （log2 （倍数 变化） <-0.58 ， P 值 <0.05） ， 证实 该 LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию рака легких и печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, p-значение <0,05), что подтверждает надежность этого скрининга (рис . 1b). LINC00205, ki te deja rapòte pwogresyon kansè nan poumon ak fwa 58,59,60, te eskli (log2 (pliye chanjman) <-0.58, p-valè <0.05), ki konfime solidite tès depistaj sa a (Fig. .1b).
Pami tout lncRNA yo teste, yo te teste DARS-AS1 tou, ak twa oligonukleotid sgRNA ankouraje yo redwi siyifikativman apre 18 jou nan kilti, sijere ke knockdown nan lncRNA sa a te lakòz pwopagasyon kansè redwi (Fig. 1b).Rezilta sa a te sipòte plis pa analiz MTS nan selil kansè kolorektal ki montre ke pousantaj kwasans nan selil knockdown DARS-AS1 te sèlman mwatye konpare ak selil kontwòl (Figi 1c) e li te konsistan avèk rapò anvan plizyè lòt kalite kansè.: kansè nan ren selil klè, kansè tiwoyid ak kansè nan poumon ki pa ti selil51,52,53,55.Sepandan, fonksyon li yo ak mekanis molekilè nan kansè kolorektal rete enkonu.Se poutèt sa, nou te chwazi lncRNA sa a pou plis etid.
Pou etidye ekspresyon DARS-AS1 nan pasyan yo, nou analize konplè 10,327 echantiyon timè nan pwojè Cancer Genome Atlas (TCGA).Rezilta nou yo montre ke DARS-AS1 se lajman eksprime ak siyifikativman upregulated nan selil ki an sante nan yon varyete de timè, ki gen ladan adenokarcinom kolon (COAD), karsinom selil ren klè (KIRC), ak karsinom selil papilè ren (KIRP)..Trè kèk (figi 1d ak Figi siplemantè 1a, b). Analiz de pè echantiyon sante / timè konfime plis ekspresyon DARS-AS1 ki pi wo nan timè nan kansòm urothelial blad (BLCA), ren ren selil klè (KIRC), adenokarcinom pwostat (PRAD), kansòm selil squamous nan poumon (LUSC) , uterin corpus endometrial karsinom (UCEC), adenokarsinòm nan poumon (LUAD), fwa epatoselilè karsinom (LIHC), ren ren papilary selil karsinom (KIRP), ak kolon adenokarcinom (COAD) (valè p <0.05) (Fig. 1e-m) . Analiz de pè echantiyon sante / timè konfime plis ekspresyon DARS-AS1 ki pi wo nan timè nan kansòm urothelial blad (BLCA), ren ren selil klè (KIRC), adenokarcinom pwostat (PRAD), kansòm selil squamous nan poumon (LUSC) , uterin corpus endometrial karsinom (UCEC), adenokarsinòm nan poumon (LUAD), fwa epatoselilè karsinom (LIHC), ren ren papilary selil karsinom (KIRP), ak kolon adenokarcinom (COAD) (valè p <0.05) (Fig. 1e-m) .Analiz de pè echantiyon sante / timè konfime tou ekspresyon siyifikativman pi wo nan DARS-AS1 nan blad pipi urothelial karsinom (BLCA), klè selil ren ak ren selil ren (KIRC), adenokarcinom pwostat (PRAD), timè squamous cell carcinoma (LUSC)., карцинома эндометрия тела матки (UCEC), аденокарцинома легкого (LUAD), гепатоцеллюлярная карцинома печени (LIHC), папиллярно-клеточная карцинома почки (KIRP) и аденокарцинома толстой кишки (COAD) (значение p <0,05) (рис. 1e– m). , karsinom andometrial nan kò matris la (UCEC), adenokarsinòm nan poumon (LUAD), karsinom epatoselilè nan fwa a (LIHC), kansè selil papilè nan ren an (KIRP), ak adenokarsinòm nan kolon an (COAD) (valè p < 0.05) (Fig. 1e– m) .配对 健康/肿瘤样本 的 进一步 证实 了 DARS-AS1 在 膀胱 上 皮癌 皮癌 (BLCA)显着 高 高 ， 子宫体子宫 内膜 （UCEC） ， 肺腺癌 （Luad） ， 细胞癌 （Lihc） <0.05）（图1e-m） .配 健康 健康/肿瘤样本 的 证实 了 了 了 了 了 了 了 了 了 了 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 、 肾 肾 肾 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 肾 肾 肾 肾 肾 肾 肾 肾(LUSC) 肿瘤 的 的 的 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 显着 更 高 表达 ， 内膜 癌 （（）癌 （kirp） （coad） （p 值<0.05）（图1e-m） .Analiz de echantiyon ki an sante/timè pè plis sipòte wòl DARS-AS1 nan blad pipi urothelial kansòm (BLCA), klè selil ren selil karsinom (KIRC), pwostat adenokarcinom (PRAD), ak timè squamous cell carcinoma (LUSC).экспрессия при карциноме тела матки (UCEC), аденокарциноме легкого (LUAD), гепатоцеллюлярной карциноме (LIHC), почечно-почечной папиллярно-клеточной карциноме (KIRP) и аденокарциноме толстой кишки (COAD) (значение p <0,05) (рис. 1e -m). ekspresyon nan corpus matris karsinom (UCEC), poumon adenokarcinom (LUAD), epatoselilè karsinom (LIHC), ren papilary selil karsinom (KIRP), ak kolon adenokarcinom (COAD) (p valè <0.05) (Figi 1e -m).Ansanm, rezilta sa yo endike ke DARS-AS1 eksprime lajman ak anpil nan yon varyete kansè.
Paske DARS-AS1 ak DARS (jèn ki kode strand antisans la) pataje menm pwomotè a epi yo sitiye youn akote lòt, nou te fèt shRNA pou kraze DARS-AS1 espesyalman men pa DARS (figi siplemantè 2a, b ak tab siplemantè 2) .Anplis SW620, nou te itilize tou twa lòt liy selil ki trè eksprime DARS-AS1 pou etidye efikasite ak fonksyon knockdown shRNA (Tablo Siplemantè 3).Rezilta nou yo te endike ke tout twa shRNA yo te devlope reyalize omwen 80% efikasite knockdown DARS-AS1 ak ti efè sou kantite DARS mRNA (Siplemantè Fig. 2c-f).Anplis de sa, nou te jwenn ke DARS-AS1 knockdown ak shRNA sa yo siyifikativman inibit kwasans selil nan liy selil kansè kolore SW620 (49.7%) ak HCT116 (27.7%), liy selil kansè nan tete MBA-MD-231 (53.4%).) ak liy selil HepG2 epatoma (92.7% rediksyon), osi byen ke kapasite yo pou fòme esfè ki pa ankre (mwayèn rediksyon ~ 50.8%, 44.6%, 40.7% ak 75.7% pou chak liy selil) (Fig. 2a, b).Nan SW620, rezilta tès fòmasyon koloni yo te konfime ke DARS-AS1 shRNA siyifikativman anpeche pwopagasyon selilè ak yon diminisyon mwayèn apeprè 69.6% (Fig. 2c).
Efè kontwòl shRNA ak DARS-AS1 shRNA sou pwopagasyon selil (a) ak fòmasyon spheroid (b) nan selil SW620, HCT116, MBA-MD-231, ak HepG2.c Efè kontwòl shRNA ak DARS-AS1 shRNA sou fòmasyon koloni nan selil SW620.Pwopagasyon selil (d), fòmasyon spheroid (e), ak fòmasyon koloni (f) selil SW620 ki overexpressing DARS-AS1.Done yo montre yo se mwayèn ± devyasyon estanda twa eksperyans.* p ≤ 0.05, ** p ≤ 0.01, ak *** p ≤ 0.001 pa tès t Student de-ke.
Pou konpleman etid pèt fonksyon, nou pwochen te kreye selil SW620 ki overexpressing DARS-AS1 (figi siplemantè 2g).DARS-AS1 overexpression siyifikativman ogmante kwasans selil (1.8-pliye), fòmasyon spheroid ki pa ankre (1.4-pliye), ak fòmasyon koloni (3.3-pliye) nan selil SW620 (figi 2d-f).Nou konfime rezilta sa a lè l sèvi avèk yon lòt liy selil eksprime DARS-AS1, A549.Pwopagasyon selil amelyore sa a akòz overexpression DARS-AS1 te obsève plis nan selil A549 (Siplemantè Fig. 2h, i ak Tablo Siplemantè 3).Ansanm, etid sa yo genyen ak pèt demontre ke DARS-AS1 ankouraje pwopagasyon selil kansè nan vitro.
Pou eksplore mekanis ki kache nan ki DARS-AS1 kontwole pwopagasyon selil yo, nou te fè yon analiz RNA rale desann pou idantifye potansyèl patnè pwoteyin obligatwa li yo.Rezilta RT-qPCR yo te montre ke apeprè 86.2% nan DARS-AS1 sitiye nan sitoplasm nan selil SW620 (Siplemantè Fig. 3a).Lè sa a, te transkri nan vitro biotinylated DARS-AS1 oswa pseudoRNA enkubasyon ak SW620 lysates selil ki te swiv pa separasyon SDS-PAGE.Tach ajan ki vin apre yo te montre ke yon bann diferan (~ 38 kDa) te siyifikativman rich nan echantiyon rale DARS-AS1 men se pa nan echantiyon RNA egare oswa pèl (figi 3a).Gwoup sa a te idantifye kòm yon pwoteyin aktive PKR (PACT) pa mas spectrometri (MS) ak plis konfime pa imunoblotting nan SW620, HCT116, ak liy selil HepG2 (figi 3a, b).Anrichisman DARS ak pwoteyin PACT ki gen rapò - PKR ak TRBP - te envestige tou lè l sèvi avèk analiz RNA pa Western blot (WB).Rezilta yo endike ke pa gen okenn entèraksyon dirèk ant DARS-AS1 RNA ak twa pwoteyin sa yo te jwenn (Siplemantè Fig. 3b).Entèraksyon espesifik ant DARS-AS1 ak PACT te konfime plis pa analiz RNA immunoprecipitation (RIP), ki te montre ke DARS-AS1 te siyifikativman rich nan antikò anti-PACT men pa lòt RNA kontwòl (Figi 3c).Pou detèmine si DARS-AS1 reyaji dirèkteman ak PACT nan absans nenpòt lòt konpozan selilè, yo te fè yon tès entèferometri in vitro biolayer (BLI) lè l sèvi avèk PACT pirifye.Biotin ki make DARS-AS1 oswa RNA enbesil te imobilize sou streptavidin (SA) biosensors ak Lè sa a, enkubasyon nan tanpon sinetik ki gen 1 μM PACT.Miyò, PACT mare fòtman nan DARS-AS1 (KD valè ~ 26.9 nM), men se pa imite RNA (Figi 3d).Ansanm, rezilta sa yo demontre yon entèraksyon dirèk ak gwo afinite ant DARS-AS1 ak PACT.
Analiz RNA rale idantifye DARS-AS1 kominike avèk PACT nan selil SW620.Pi wo a, tach ajan nan pwoteyin ki gen rapò.Lower immunoblots yo te fèt ak antikò anti-PACT.b analiz RNA pull-down te fèt nan selil HCT116 (anwo) ak HepG2 (anba).Anrichisman PACT te detekte pa imunoblot.Yo te fè tès iminopresipasyon cRNA (RIP) nan selil SW620 lè l sèvi avèk antikò ki endike yo.d PACT koub obligatwa nan tout longè DARS-AS1 oswa RNA kontwòl yo te jwenn lè l sèvi avèk entèferometri byolay (BLI).RNA te immobilize sou yon biosensor streptavidin.1 μM PACT te itilize pou mezire asosyasyon.Yo te fè tès RNA rale lè l sèvi avèk DARS-AS1 plen longè biotinyl oswa tronke (anwo).Immunoblot ki montre PACT te resevwa (anba).f PACT ki make pirifye yo te enkube ak DARS-AS1 plen longè biotinyl oswa tronke (tankou nan e) pou tès RIP in vitro.RNA ekstrè a te verifye pa RT-qPCR.g Yo te jwenn afinite relatif diferan fragman RNA pou PACT lè l sèvi avèk entèferometri byolay.Pou analiz, yo te itilize 100 nM RNA ak 1 μM RAST.h Yo te fè tès RIP in vitro lè l sèvi avèk PACT pirifye entak oswa twonke.RNA ekstrè a te verifye pa RT-qPCR.i Pousantaj kwasans selil SW620 ki twò eksprime DARS-AS1, PACT, oswa toude.j Twò ekspresyon de tout longè oswa twonke DARS-AS1 nan selil SW620 te gen diferan efè sou kwasans selil.k Apoptoz te detekte pa imunoblot ak antikò anti-PARP.l Knockout nan DARS-AS1 pwovoke apoptoz nan selil SW620 jan yo montre nan sitometri koule.Done yo montre yo se mwayèn ± devyasyon estanda twa eksperyans. *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p <0.0001, pa tès t Student de-ke. *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p <0.0001, pa tès t Student de-ke. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p < 0.0001 pa tès t Student de-ke. *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p < 0.0001，通过双尾学生t 检验。 *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p < 0.0001，通过双尾学生t 检验。 *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p <0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p < 0.0001 pa tès t Student de-ke.
Lè sa a, nou te pwodwi twa fragman RNA DARS-AS1 biotinyl pa transkripsyon in vitro pou idantifye rejyon DARS-AS1 ki nesesè pou asosyasyon PACT (Figi 3e).Rezilta analiz RNA yo te montre ke chak fragman te kapab kominike avèk PACT, men rejyon an 3′-tèminal (384-768 nukleotid ki make A3) te montre plis pase 1-384 nukleotid ki make A1) (Fig. 3e).Rezilta menm jan an te obsève nan tès RIP in vitro lè l sèvi avèk PACT recombinant (Figi 3f).Konfòm ak rezilta sa yo, eksperyans yo mare fragman RNA immobilize nan PACT lè l sèvi avèk BLI tou te montre ke PACT gen yon pi gwo afinite pou A3 (384-768 nt) (KD valè apeprè 94.6 nM), pandan y ap prèske pa gen lyen ak lòt zòn.(figi 3d).
Nou te egzamine tou rejyon obligatwa ki asosye yo nan PACT.PACT gen twa domèn fonksyonèl, de nan yo se konsève doub-branding domèn RNA-obligatwa (dsRBD) ak yon twazyèm domèn (deziyen D3) ki aji kòm yon aktivateur nan entèraksyon pwoteyin.Pou egzamine kapasite lncRNA obligatwa chak domèn, nou te kreye twa mitasyon ki te retire chak nan twa domèn yo epi nou te fè yon tès RIP in vitro.Rezilta nou yo te montre ke sipresyon twazyèm domèn (D3) nan PACT siyifikativman redwi entèraksyon li yo ak DARS-AS1 (pa 0.11-pliye konpare ak PACT entak) konpare ak de lòt mitasyon yo (Fig. 3h), li te montre ke liberasyon an. nan D3 te kominike avèk DARS.-AC1.Ansanm, rezilta sa yo sijere ke entèraksyon ant DARS-AS1 ak PACT ka rive sitou nan fen 3′ nan DARS-AS1 ak domèn D3 nan PACT.
Nou te note ke DARS-AS1 pa te gen okenn efè sou ekspresyon PACT ak PACT pa te gen okenn efè sou DARS-AS1 (figi siplemantè 3c).Lè sa a, nou te egzamine efè PACT knockdown sou kwasans selil yo.Kontrèman ak DARS-AS1, selil relatif yo te grandi 1.5-3 fwa pi vit lè PACT te kraze (figi siplemantè 3d).Rezilta yo nan tès fòmasyon koloni yo endike ke selil yo te fòme koloni 2-3-pliye apre tretman shRNA ak PACT (figi siplemantè 3e).Pou teste si DARS-AS1 kontwole pwopagasyon selil atravè PACT, nou te pwodwi selil SW620 ki overexpressing PACT, DARS-AS1, oswa toude.Ekspresyon twòp nan PACT te montre siyifikatif anpèchman nan pwopagasyon selil (Figi 3i).Pandan ke DARS-AS1 overexpress per se siyifikativman ankouraje pwopagasyon selil, pa te gen okenn diferans enpòtan nan to kwasans selil yo overexpressing DARS-AS1 ak PACT.Rezilta sa yo sijere ke PACT ka debat pwopagasyon ogmante ki te koze pa twòp ekspresyon DARS-AS1.
Depi diferan rejyon nan DARS-AS1 gen diferan kapasite PACT-obligatwa, nou te envestige enfliyans relatif yo sou pwopagasyon selil pa ekspresyon diferan nan fragman DARS-AS1.Konpare ak de lòt fragman yo, DARS-AS1 te overexpressed nan fen 3 '(384-768 nt), rejyon prensipal ki gen rapò ak PACT nan DARS-AS1, ki te gen pi gwo kapasite nan estimile pwopagasyon selil (Fig. 3j).Rezilta sa yo endike yon korelasyon pozitif ant kapasite obligatwa ak fonksyon byolojik DARS-AS1.
Yo rapòte PACT se yon pwoteyin pro-apoptotik19.Se poutèt sa, nou te envestige efè DARS-AS1 sou apoptoz.Kòm espere, DARS-AS1 knockdown siyifikativman ogmante PARP klivaj nan selil SW620 ak ogmante pwopòsyon an nan selil annexin V-pozitif nan SW620, HCT116, HepG2, ak MBA-MD-231 liy selil (Fig. 3k).3).3f-h), ki endike ke efè anti-apoptotik DARS-AS1 nan selil kansè yo opoze ak fonksyon PACT ki pwovoke apoptoz la.Ansanm, rezilta sa yo sijere ke mekanis nan fonksyon onkojenik DARS-AS1 ka nan anpèchman nan fonksyon PACT.
Apre sa, nou te eksplore enplikasyon fonksyonèl asosyasyon DARS-AS1-PACT.Yo te rapòte ke PACT aktive PKR atravè entèraksyon dirèk, ki imedyatman amelyore fosforilasyon eIF2α, sa ki lakòz sipresyon tradiksyon ak apoptoz17.Premyèman, nou te egzamine si DARS-AS1 afekte lokalizasyon selilè PACT ak PKR.Mikwoskopi fliyoresan konfokal te montre ke PACT ak PKR yo te trè colocalized nan selil SW620 ak yon mwayèn koyefisyan korelasyon Pearson nan 0.72.Pandan se tan, DARS-AS1 twòp ekspresyon siyifikativman redwi PACT ak PKR ko-lokalizasyon (vle di Pearson koyefisyan korelasyon 0.61) (Figi 4a).Pou mennen ankèt sou si wi ou non DARS-AS1 te kapab modile entèraksyon PACT-PKR, nou te fè yon tès ko-immunoprecipitation (ko-IP) ak antikò anti-PACT nan lysate selil SW620.PKR te trè rich nan anti-PACT nan selil kontwòl, pandan y ap rekiperasyon PKR te siyifikativman redwi nan lysates soti nan selil overexpressing DARS-AS1 (Fig. 4b).Yo te itilize PACT ak PKR ki make pirifye pou tès obligatwa pwoteyin in vitro.An konsekans, moun ki bay DARS-AS1 men pa gen okenn RNA kontwòl te montre entèraksyon PACT-PKR siprime (Figi 4c).Tout rezilta yo te montre ke DARS-AS1 deranje kominikasyon PACT ak PKR.
yon ko-lokalizasyon PACT ak PKR nan selil kontwòl oswa selil ki overexpressing DARS-AS1 te obsève lè l sèvi avèk mikwoskopi fliyoresan konfokal.Nwayo yo te tache ak DAPI.Rezilta estatistik yo te jwenn nan 16 foto.b Co-immunoprecipitation (ko-IP) lè l sèvi avèk anti-PACT antikò nan selil lysates nan selil kontwòl SW620 oswa selil ki overexpressing DARS-AS1.c Te gen etikèt PACT, pirifye PKR ak transkri nan vitro ak DARS-AS1 oswa mock RNA yo te enkube pou analiz nan vitro pwoteyin obligatwa.Antikò anti-drapo yo te itilize pou imunopresipasyon.d Immunoblots ak antikò ki endike yo te fèt nan selil SW620 ak HCT116 transfekte ak shRNA kontwòl oswa DARS-AS1-shRNA ki te swiv pa grangou serom.e nivo ekspresyon DARS-AS1 chanje sansiblite selilè a thapsigargin.Selil SW620 yo te transfekte ak shRNA DARS-AS1, plasmid overexpression DARS-AS1 oswa plasmid kontwòl.Selil yo te trete ak thapsigargin pou 48 èdtan epi yo te detèmine viabilite selil yo lè l sèvi avèk reyaktif MTS la.f Yo te itilize DARS-AS1 transkri in vitro oswa RNA enbesil ak PACT pirifye pou tès aktivasyon an vitro ak deteksyon imunoblot.g Yo te fè imunoblot ki itilize antikò sa yo sou selil SW620-ctrl (agòch) oswa selil ki eksprime mutan PKR (adwat).Lè sa a, selil sa yo te transfekte ak shRNA kontwòl oswa DARS-AS1-shRNA ki te swiv pa grangou serom.h Sitometri koule te montre ke inaktivasyon PKR mitasyon an konpanse pou apoptoz DARS-AS1-induit nan selil SW620 yo.i Immunoblots ak antikò ki endike yo te fèt nan selil SW620 (agòch) oswa HCT116 (adwat).Selil transfekte ak shRNA kontwòl oswa shRNA DARS-AS1 yo prive nan serom epi yo konplete avèk 100 nM PKR C16 inhibitor oswa DMSO.Ba echèl = 5 µm.Done yo montre yo se mwayèn ± devyasyon estanda twa eksperyans.* p ≤ 0.05 Egzamen t Student de-ke.
Yo jeneralman kwè ke yon fwa PACT reyaji ak PKR17, PKR fosforilasyon nan Thr451 ka pwovoke.Rezilta nou yo te endike ke nivo fosforilasyon PKR te siyifikativman elve nan selil knockdown DARS-AS1 apre grangou serom (figi 4d ak Figi siplemantè 4a).An konsekans, nou te jwenn ke fosforilasyon eIF2α, prensipal substra PKR la, te siyifikativman ogmante tou pa DARS-AS1 shRNA (Fig. 4d ak Figi Siplemantè 4a).Thapsigargin se yon estrès ER ki lakòz ER la lage Ca2+.Yo te rapòte tretman ak thapsigargin pwovoke ekspresyon ak aktivasyon PACT, ki pi plis reyaji ak aktive PKR, ki mennen nan apoptoz lè yo ogmante fosforilasyon eIF2α 18,61.Isit la, nou itilize thapsigargin kòm yon stimulateur nan chemen PACT/PKR pou mennen ankèt sou si DARS-AS1 ka ede selil yo simonte estrès lè yo anpeche chemen PACT/PKR la.Nou te obsève ke nivo ekspresyon DARS-AS1 te gen rapò pozitivman ak rezistans selil nan thapsigargin.Selil SW620 ki overexpressing DARS-AS1 te siviv pi byen lè yo te trete ak thapsigargin, pandan ke selil ki gen DARS-AS1 knockdown te vin pi sansib (Fig. 4e).Konfòm ak rezilta sa yo, DARS-AS1 twòp ekspresyon redwi fosforilasyon PKR thapsigargin-induit (Siplemantè Figi 4b).Kontrèman, apre tretman thapsigargin, PKR ak eIF2α te fosforilate nan yon pi wo limit nan selil knockdown DARS-AS1 konpare ak selil kontwòl (figi siplemantè 4b).Enteresan, thapsigargin pwovoke ekspresyon DARS-AS1 nan yon fason ki depann de dòz la, ki ka endike yon fonksyon anti-estrès nan DARS-AS1 (figi siplemantè 4c).Anplis de sa, nou te fè tès aktivasyon vitro pou konfime obsèvasyon sa yo.Yon ti tan, PKR te pirifye soti nan lysate selil lè l sèvi avèk yon antikò anti-PKR, Lè sa a, enkube ak PACT recombinant ak DARS-AS1 transkri nan vitro.Apre reyaksyon anzimatik la, yo te detekte fosfo-PKR lè l sèvi avèk WB.Rezilta nou yo te endike ke PKR fosforilasyon te siyifikativman inibit pa DARS-AS1, men se pa pa RNA kontwòl (Figi 4f).Rezilta sa yo in vitro ak in vivo sijere ke DARS-AS1 inibit PACT-medyatè aktivasyon PKR.An menm tan an, nou te obsève tou yon diminisyon nan rekiperasyon PACT nan prezans DARS-AS1 (Figi 4f).Rezilta sa a ki konsistan avèk rezilta yo nan tès la obligatwa pwoteyin in vitro (Figi 4c) epi ankò ilistre fonksyon an bloke nan DARS-AS1 pou asosyasyon PACT-PKR.
Ser246 ak Ser287 nan domèn D3 nan PACT yo obligatwa pou deklanchman PKR anba estrès selilè.Sibstitisyon de résidus serin pou alanine te bay mutan PACT (mutD), ki aktive PKR nan absans estrès, ak sibstitisyon pou alanine (mutA) ranvèse pwotokòl la.Depi nou te demontre enpòtans domèn sa a nan asosyasyon dirèk ak DARS-AS1, nou te pwodwi de mutan PACT sa yo pou teste si rezidi sa yo ta ka patisipe tou nan entèraksyon ak DARS-AS1.Enteresan, tou de mutan yo pèdi kapasite pou yo mare nan DARS-AS1 (figi siplemantè 4d), sijere ke estrikti konplè pwoteyin PACT la ka nesesè pou entèraksyon efikas ak DARS-AS1.
Anplis de sa, rezilta nou yo tou sijere ke DARS-AS1-shRNA-induit anpèchman nan pwopagasyon selil yo ka pasyèlman retabli pa overexpressing yon dominan negatif PACT mutan (PACTmutA) oswa yon dominan negatif PKR mutan (PKRmut) (Siplemantè Fig. 4e. e).Ekspresyon twòp nan mutan PKR dominan-negatif redwi fosforilasyon PKR ki te pwovoke pa knockdown DARS-AS1 kòm byen ke fosforilasyon eIF2α nan selil serom-prive (figi 4g).Sa ki pi enpòtan, pwopòsyon selil apoptotik ki te pwovoke pa knockdown DARS-AS1 te redwi tou nan selil ki overexpressing PKRmut (figi 4h ak Figi siplemantè 4g).Anpèchman aktivite PKR kinaz tou afekte fonksyon DARS-AS1, kòm rezilta yo te montre ke DARS-AS1 knockdown raman deklanche PKR ak eIF2α fosforilasyon lè selil yo te trete ak yon inibitè C16 PKR-espesifik (figi 4i ak Figi siplemantè 4h).).Ansanm, rezilta nou yo sijere ke DARS-AS1 ankouraje pwopagasyon selilè, omwen an pati, lè yo anpeche deklanchman PKR ki baze sou PACT.
Pou plis eksplore wòl DARS-AS1 nan tumorigenesis, nou te fè eksperyans nan vivo lè l sèvi avèk yon modèl xenograft sourit. Rezilta yo montre ke knockdown nan DARS-AS1 dramatikman diminye kwasans timè nan sourit (valè p <0.0001) (Fig. 5a). Rezilta yo montre ke knockdown nan DARS-AS1 dramatikman diminye kwasans timè nan sourit (valè p <0.0001) (Fig. 5a). Результаты показывают, что нокдаун DARS-AS1 резко снижает рост опухоли у мышей (значе,ни00.)5 (значе,ни0.с.15). Rezilta yo montre ke DARS-AS1 knockdown drastikman diminye kwasans timè nan sourit (valè p <0.0001) (Figi 5a).结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p 值<0.0001）（图5a（图5a（结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p值<0.0001）（图5a）。 Результаты показали, что нокдаун DARS-AS1 значительно снижает рост опухоли у мышей у мышей (зна0.1) (значительно снижает). Rezilta yo te montre ke DARS-AS1 knockdown siyifikativman redwi kwasans timè nan sourit (valè p <0.0001) (Figi 5a).Kidonk, nan gwoup knockdown DARS-AS1, te gen yon diminisyon enpòtan nan volim timè mwayèn pa apeprè 72.9% ak mas timè vle di pa apeprè 87.8% (Figi 5b-d).Rezilta sa yo fòtman sijere ke DARS-AS1 ka siyifikativman ankouraje kwasans timè nan vivo.
Efè debat DARS-AS1 sou onkojenèz kolorektal nan sourit toutouni.Yo montre koub kwasans (a), gwosè timè (b), pwa (c), ak imaj timè (d).Ba erè reprezante ±SEM. n = 10. ****p < 0.0001, pa tès t Student de-ke. n = 10. ****p < 0.0001, pa tès t Student de-ke. n = 10. ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. n = 10. ****p < 0.0001 Tès T Student de-ke.n = 10. ****p < 0.0001，通过双尾学生t 检验。 ****p < 0.0001，通过双尾学生t检验。 ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. ****p < 0.0001 Tès etidyan de-ke.e Kaplan-Meier analize korelasyon ki genyen ant nivo ekspresyon DARS-AS1 ak siviv jeneral nan pasyan ki gen UVM, KICH, KIRP, MESO, GBM, ak LGG.Nivo segondè nan ekspresyon DARS-AS1 nan pasyan yo te nan tèt 50%;nivo ki ba nan ekspresyon DARS-AS1 nan pasyan yo te nan anba a 50%.p-valè yo te detèmine lè l sèvi avèk tès la ran.f Modèl pwopoze kote DARS-AS1 kontwole chemen PACT-PKR ak kwasans timè.
Pou pi byen konprann enpak klinik DARS-AS1, nou te egzamine korelasyon ki genyen ant ekspresyon li ak siviv pasyan yo.Lè nou analize done TCGA a, nou te jwenn ke pi wo ekspresyon DARS-AS1 te asosye ak melanom uveal (UVM), kwomofobi ren (KICH), karsinom selil papilè ren (KIRP), mesothelioma (MESO), multiplex.Siviv pi ba yo te siyifikativman asosye ak mòfoz glioblastoma (GBM) ak pasyan ki gen gliom nan sèvo ki ba-klas (LGG) (Figi 5e).Rezilta sa yo sijere ke DARS-AS1 ka jwe yon wòl enpòtan nan pwogresyon timè klinik epi li ka yon potansyèl biomarker prediksyon nan plizyè kansè.
Nan etid sa a, lè l sèvi avèk tès depistaj fonksyonèl CRISPRi gwo echèl, nou detèmine ke DARS-AS1 lncRNA simonte estrès selil kansè nan reglemante de sekouris estrès kle, PACT ak PKR.Lè yo kominike dirèkteman ak PACT, DARS-AS1 anpeche deklanchman PACT-medyatè PKR, kidonk anpeche lanmò selil apoptotik ak ankouraje pwopagasyon selil (Fig. 5f).Yo te obsève regilasyon DARS-AS1 nan plizyè kalite kansè, sa ki sijere ke fonksyon li pou ankouraje siviv selil kansè nan kondisyon estrès ka lajman aplikab a plizyè kalite kansè.
PACT te idantifye kòm yon pwoteyin activateur PKR, ak PACT-medyatè deklanchman PKR jwe yon wòl enpòtan nan repons estrès pa reglemante transkripsyon, tradiksyon, apoptoz, ak lòt pwosesis selilè enpòtan62.Pandan plizyè deseni, yo te fè tantativ pou konprann règleman espesifik kansè PACT-PKR kaskad la.Isit la, etid nou an revele yon mekanis diferan nan règleman PACT-PKR nan selil kansè yo atravè selilè lncRNA DARS-AS1, ki dirèkteman mare ak PACT, bloke entèraksyon PACT-PKR, anpeche aktivasyon PKR ak fosforilasyon eIF2α, kidonk anpeche apoptoz estrès pwovoke ak ankouraje pwopagasyon kansè evantyèlman.selil yo.Dekouvèt sa a bay limyè sou potansyèl lncRNA objektif pou pronostik kansè ak terapi.
Done nou yo te montre ke DARS-AS1 knockdown sansibilize selil yo nan grangou serom ak yon ogmantasyon siyifikatif nan fosforilasyon PKR ak eIF2α.Rezilta sa yo sijere ke DARS-AS1 ankouraje siviv selil kansè nan kondisyon piman bouk lè yo anpeche aktivite PACT/PKR.Plizyè lòt RNA ki pa kode, tankou ASPACT ak nc886, yo patisipe tou nan aks PACT / PKR pa downregulating PACT48 mRNA oswa reglemante autophosphorylation pa obligatwa PKR49,50,64.Pami yo, DARS-AS1 aji kòm yon deranje asosyasyon PACT-PKR.Etid sa a anrichi konpreyansyon nou sou règleman PACT/PKR aks ak wòl lncRNAs nan repons estrès.
PACT gen twa domèn separe.Chak nan de premye dsRBD yo ase pou reyalize gwo affinite obligatwa PACT ak PKR, pandan y ap twazyèm domèn (D3) obligatwa pou aktivasyon PKR nan vitro ak nan vivo.Etid nou an te montre ke DARS-AS1 preferansyèlman reyaji ak domèn D3 a (figi 3h).Bay gwo gwosè lncRNA a (768 nukleotid), DARS-AS1 obligatwa nan D3 ka fizikman anpeche entèraksyon ki genyen ant domèn PACT nan dsRBD ak PKR, kidonk bloke asosyasyon PACT ak PKR.PACT mitasyon pwen ki ranplase Ser246 ak Ser287 nan D3 ak alanine oswa aspartate deranje afinite obligatwa li yo pou DARS-AS1, montre enpòtans ki genyen nan pwopriyete jeneral estriktirèl ak elektrik D3 nan asosyasyon yo.Plis detay sou mekanis sa a pral mande nan tan kap vini an, lè l sèvi avèk analiz byochimik pi presi ak analiz estriktirèl PACT rezolisyon segondè.
Etid anvan yo te rapòte ke DARS-AS1 ankouraje pwopagasyon selil atravè plizyè mekanis51,52,53.Nan yon egzanp, envestigatè yo te obsève ke DARS-AS1 kontwole jèn DARS ki kode pwoteyin antisans li yo lè yo vize miP-194-5p nan selil kansè nan ren yo.Sepandan, nan etid la prezan, defonsman DARS-AS1 te gen yon ti efè sou transkripsyon DARS nan plizyè kalite kansè, ki gen ladan omwen kansè kolorektal, tete ak fwa.Paske lncRNA yo montre modèl ekspresyon espesifik selil ak tisi yo, mekanis fonksyonèl yo ka pa konsève nan tout kalite kansè yo, ki ka kontribye nan diferans sa a ant obsèvasyon nou yo ak evalyasyon anvan yo sou diferan kansè.Syans espesyal yo bezwen pou elicide mekanis espesifik divès pwosesis fizyolojik ak patolojik.
Yon analiz de done klinik yo te montre ke ekspresyon DARS-AS1 nan timè se envès korelasyon ak siviv pasyan kansè yo, ki souliye enpòtans ki genyen nan aks DARS-AS1/PACT/PKR nan pronostik kansè.An konklizyon, etid nou an montre ke DARS-AS1 se yon regilatè nan aks siyal PACT / PKR la, ankouraje pwopagasyon selil kansè yo, ak inibit apoptoz pandan repons estrès la, ki bay yon lòt liy rechèch epi ki enterese pou rechèch nan lavni nan tretman potansyèl. .
Liy selil imen SW620, A549, MBA-MD-231, HCT116, HepG2 ak HEK293T yo te jwenn nan Enfrastrikti Nasyonal Resous Liy Selil nan Lachin.Tout selil yo te konsève nan mwayen DMEM (DMEM, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) siplemantè ak 10% FBS (Gemini, Brooklyn, NY) ak 1% penisilin-streptomycin (Thermo Fisher Scientific) nan 37 ° C, 5% CO2.enkibatè.
Anti-PACT, Abcam (ab31967);Anti-PKR, Abcam (ab184257);Anti-PKR (fosfo-T451), Abcam (ab81303);Anti-drapo, Abcam (ab125243);Anti-eIF2α, Abcam (A0764));anti-eIF2α (fosfò S51), Abcam (ab32157);anti-PACT (fosfò S246), Abgent (AP7744b);anti-β-tubulin, CST (2128);nòmal sourit IgG, CST (5415S);nòmal lapen IgG, CST (2729S).Antikò yo te dilye 1:1000 nan PBST pou Western blotting ak 1:100 pou IP.
sgRNA yo te devlope lè l sèvi avèk yon zouti piblik ki disponib ki rele CRISPR-ERA66.Nou itilize paramèt zouti default yo pou devlopman sgRNA ak algorithm yo kalkile sit obligatwa sgRNA nan rejyon an 3 kb.santre nan TSS.Pisin oligonukleotid sgRNA yo te sentèz nan CustomArray, Inc. (Bothewell, WA) ak klonaj nan plasmid pgRNA imanize (Addgene #44248).Yon total de 12 µg plasmid pgRNA imanize pisin, 7.2 µg psPAX2 (Addgene #12260), ak 4.8 µg pMD2.G (Addgene #12259) yo te ko-transfekte nan 5 x 106 HEK293T nan 10 cm transfèksyon dishes ADN. selil (CWBIO, Beijing, Lachin) swiv enstriksyon manifakti a.Surnatant ki gen viris yo te kolekte 48 ak 72 èdtan apre transfeksyon epi yo te filtre atravè yon filtè 0.45 µm.Pou tès depistaj, selil SW620 ki eksprime pwoteyin fizyon dCas9/KRAB yo te jwenn pa transdiksyon viris.Modifye selil SW620 yo te enfekte ak bibliyotèk viris la nan kat eksperyans enfeksyon endepandan nan yon MOI nan 0.1-0.3 epi yo te pran echantiyon ak 2 μg / ml puromicin (Sigma, St. Louis, MO) pou 2 jou.Apre sa, selil yo te kiltive pou 18 jou an vitro ak yon kouvèti bibliyotèk minimòm 500 selil / sgRNA pou tès depistaj.
Genomic DNA te extrait selon enstriksyon QIAamp DNA Blood Midi Kit (QIAGEN, Düsseldorf, Almay; 51183).An total, yo te itilize 100 μg ADN jenomik pou chak repete byolojik pou bati bibliyotèk la.Te rejyon an sgRNA anplifye pa de jij nan PCR ak lye nan yon kòd bar.
Pwodwi PCR yo te pirifye lè l sèvi avèk jèl NucleoSpin® ak twous pou pirifye PCR (MACHEREY-NAGEL, Düren, Almay; 740609.250) epi yo te mezire lè l sèvi avèk twous deteksyon ADN Qubit™ HS doub-chachen (Thermo Fisher Scientific; Q32854).
Yo te itilize tès MTS la pou mezire pwopagasyon selil yo.Selil yo te simen nan plak 96-byen nan yon dansite inisyal nan 2000 selil / pi.Yo te mezire kantite relatif selil yo chak jou nan tan ki endike a pou yon total de 4-6 jou.Pou chak pi, 20 μl nan reyaktif MTS (Promega) te dilye ak 100 μl nan DMEM, enkubasyon ak selil pou 4 èdtan nan 37 ° C, ak Lè sa a, OD490 te mezire.
Kapasite pou kwasans san ankre te dekouvri nan analize fòmasyon nan esfè.Yon ti tan, 2000 selil transfekte ak shRNA DARS-AS1 oswa shRNA kontwòl yo te kiltive nan microplates ultra ba atachman (Corning) ak chanjman mwayen chak 4 jou.Esferoid yo te konte apre 14 jou.Yo te itilize 500 selil transfekte ak plasmid overexpression DARS-AS1 oswa yon plasmid kontwòl pou tès amelyorasyon an, otreman metòd la pa t chanje.
RNA te transkri lè l sèvi avèk T7 RNA polymerase ak biotin-16-UTP (Roche 1138908910) dapre enstriksyon yo nan Riboprobe® Combination Systems (Promega P1440).Jadendanfan yo itilize isit la yo ki nan lis nan Tablo Siplemantè 4.
Pwoteyin-kodaj PACT oswa PKR rejyon yo te klonaj nan pET15b (Addgene #73619) ak transfòme nan BL21 (DE3).Bakteri yo te enkube lannwit lan nan LB apwovizyone ak anpisilin ak Lè sa a, dilye 100-pliye ak LB fre.Lè OD600 mwayen an te rive nan 0.8, 1 mM IPTG te ajoute pou pwovoke ekspresyon pwoteyin.Apre enkubasyon lannwit lan ak souke dou (250 rpm nan 20 ° C), yo te ranmase grenn selil la pa santrifujasyon (4000 rpm, 10 min, 4 ° C).Resispann grenn selil la nan tanpon lysis (50 mM Tris, pH 8.0, 250 mM NaCl, 1 mM PMSF) epi enkube sou glas pou 30 minit, Lè sa a, sonike (15 min, 5 s sou / koupe, sou glas) ak santrifuje (13,000). rpm)., 30 min, 4°С).Lè sa a, sipènatant la te chaje sou rezin Ni-NTA (QIAGEN) 3 fwa nan 4 ° C, lave 4 fwa ak tanpon lave (50 mM Tris, pH 8.0, 40 mM imidazol, 250 mM NaCl) epi elite 3 fwa, ak yon total nan 10 ml tanpon eluyan (50 mM Tris, pH 8.0, 250 mM NaCl, 300 mM imidazol).Pwoteyin pirifye yo te detèmine lè l sèvi avèk WB epi yo te detèmine konsantrasyon an lè l sèvi avèk twous tès pwoteyin Qubit™ (Thermo Fisher Scientific; Q 33212).
Yo te fè tès RIP jan sa dekri anvan an, ak modifikasyon.Yon ti tan, 1x RIP tanpon (25 mM Tris-HCl, pH 7.5, 100 mM NaCl, 0.5% NP-40, RNasin ribonukleaz inhibiteur (Promega), PMSF (Beyotime Biotechnology), 1 mM DDM, proteaz) lyses sitostatik 1 x 107 bwason (Roche, 1 mM DTT) ak santrifuje nan 13,000 rpm pou 15 min nan 4 °C.Lè sa a, supernatant la te enkube ak pwoteyin A + G pèl mayetik (Millipore) konjige ak 5 μg nan anti-PACT antikò (Abeam) oswa IgG (CST).Pèl yo te lave 5 fwa ak 5x RIP tanpon, Lè sa a, dijere ak proteinase K (NEB).RNA te ekstrè ak Trizol epi detèmine pa RT-qPCR.Premye yo prezante nan Tablo Siplemantè 5.
Yo te fè tès RIP in vitro a dapre yon pwotokòl RIP estanda modifye.Yon total de 5 pmol nan RNA transkri in vitro te dilye 1x ak tanpon RIP ak rkwit pa enkubasyon nan 65 ° C pou 5 minit ki te swiv pa ralanti refwadisman nan tanperati chanm.Yo te pirifye yon total de 5 pmol nan pwoteyin PACT entak oswa mitasyon drapo ki make nan E. coli.Enkube ak RNA renature pou 2 èdtan nan 4 ° C epi swiv pwosedi ki anwo a pou analiz RIP pou anti-drapo IP.
Pou analiz ekstansyon RNA, 1 × 107 selil yo te lysed ak 1xRIP tanpon.Apre santrifujasyon nan 13,000 rpm pou 15 min nan 4 ° C, yo te pretrete supernatant la ak 30 μl pèl streptavidin mayetik (Beckman) pou 2 èdtan nan 4 ° C.Lè sa a, lisat pirifye a te apwovizyone ak tRNA ledven ak enkube ak 40 pmol nan RNA renatire lannwit lan nan 4 ° C, Lè sa a, pou yon lòt 2 èdtan ak 20 μl nan nouvo pèl streptavidin mayetik bloke ak BSA te ajoute.Etap lave a fèt 4 fwa ak 5x RIP tanpon ak 4 fwa ak 1x RIP tanpon.Pwoteyin ki koresponn yo te eliye ak tanpon elisyon biotin (25 mM Tris-HCl, pH 7.5, 12.5 mM D-biotin, PMSF) epi separe sou NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel (Invitrogen).Apre tach ajan (Beyotime Biotechnology), sèten gwoup yo te elimine ak analize pa MS.
Yo te fè analiz Co-IP pou teste entèraksyon ant PACT ak PKR.Yon ti tan, lisat supernatant yo te prepare nan enkubasyon 1 x 107 selil lysed nan 1 x RIP tanpon ki te swiv pa santrifujasyon nan 13,000 rpm pou 15 minit nan 4 ° C.Lysates yo te chaje ak pwoteyin A + G pèl mayetik, konjige ak 5 µg antikò anti-PACT, epi dousman vire lannwit lan nan 4 ° C.Pèl yo te lave 3 fwa ak 5 × tanpon RIP, de fwa ak 1 × tanpon RIP ak elite ak 1 × tanpon SDS.Pwoteyin refè a te analize pa jèl SDS-PAGE ak detekte pa WB.
De pmol PACT ak 1 pmol PKR te pirifye nan E. coli.Delye nan 1 × tanpon RIP epi enkube ak 10 pmol RNA renatire pou 2 èdtan nan 4 °C.Apre sa, yo te enkube ak pwoteyin A + G mayetik pèl-konjige antikò ki make pou yon lòt de zè de tan.Lè sa a, pèl yo te lave kat fwa ak 1x tanpon RIP ak elite ak 1x tanpon SDS.WB te detekte PACT ak PKR ki kapab lakòz.